甘松乙酸乙酯部位改善低压和低氧诱导的心肌组织损伤作用及机制△

孙杨，魏崇莉，赵彤，马慧萍，景临林*

1.联勤保障部队第九四〇医院 第一门诊部，甘肃 兰州 730050；2.联勤保障部队第九四〇医院 药剂科/全军高原医学重点实验室，甘肃 兰州 730050

心脏是专属耗氧器官，容易遭受高原缺氧的损伤[1]。研究表明，低压低氧诱导的氧化应激是导致心脏损伤的重要因素之一，而抗氧化剂能够通过抑制氧化应激改善心肌损伤[2]。天然抗氧化剂更是具有活性高、毒性低的优势，近年来备受关注[3]。甘松NardostachyschinensisBatal.以其干燥根及根茎入药，具有理气止痛、开郁醒脾的功效[4]。研究表明，甘松富含倍半萜烯、香豆素、黄酮、多酚和糖苷等化合物，具有抗癫痫、抗焦虑、抗惊厥、抗抑郁、抗疟、抗氧化、抗炎、抗心肌缺血再灌注损伤、抑菌和改善血糖代谢等广泛的生物活性[5-7]。课题组前期研究表明，甘松乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract fraction ofN.chinensis，EFNC)具有较好的体外抗氧化活性[8]。本研究考察EFNC对低压低氧诱导的心肌组织氧化应激损伤的保护作用，为其合理应用提供参考。

1 材料

1.1 试药

EFNC按照课题组报道的方法制备[8](总黄酮质量分数>150 mg·g-1)；芦丁(纯度>98%)购自陕西慈缘生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定和蛋白定量BCA法试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；核转录因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)等抗体购自Abcam公司；β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、增强化学发光法(ECL) Plus超敏发光液和聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器

FLYDWC50-IIC型低压低氧动物实验舱(贵州风雷航空军械有限公司)；CriterionTM型电泳槽(Bio-Rad公司)；Spectramax i3型多功能酶标仪(Molecular Devices公司)；Microfuge 22R型冷冻离心机(Beckman Coulter公司)；Tissuelyser-24型多样品组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)。

1.3 动物

雄性清洁级BABL/c小鼠，4周龄，体质量(20±2) g，由联勤保障部队第九四〇医院动物实验科提供，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2014-0029。

2 方法

2.1 常压密闭缺氧实验

将50只清洁级雄性BABL/C小鼠随机分为缺氧模型组、芦丁组(500 mg·kg-1)和EFNC高(500 mg·kg-1)、中(250 mg·kg-1)、低(125 mg·kg-1)剂量组，每组10只。按照相应剂量连续灌胃给药5 d，每日1次，缺氧模型组给予等量0.9%氯化钠溶液，末次给药后，将小鼠置于250 mL广口瓶中(瓶内放置5 g钠石灰用于吸收二氧化碳)，密闭瓶盖后开始计时，以最后一次大喘气为小鼠死亡指标，纪录小鼠的存活时间[9]。

2.2 低压低氧诱导心肌组织损伤模型

将36只清洁级雄性BABL/c小鼠随机分为对照组、低压低氧模型组、芦丁(500 mg·kg-1)组、EFNC(500 mg·kg-1)组，每组9只，连续灌胃给药5 d，对照组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液。末次给药后，除对照组外，其余小鼠置于低压低氧动物实验舱中，以10 m·s-1升至海拔8000 m，12 h后再以10 m·s-1将实验舱中气压升至环境大气压。小鼠眼眶取血，随即脱臼处死，摘除心脏，并按照测定要求对其进行处理[10]。

2.3 血清中心肌损伤指标测定

每组分别取6只小鼠的血液标本，3000 r·min-1离心10 min(离心半径为10 cm)，取上清。LDH、CK和CK-MB活性按照相关试剂盒说明进行测定。

2.4 心肌组织中氧化应激相关指标测定

每组分别取6只小鼠的心肌组织，称定质量后按1∶9加入冰0.9%氯化钠溶液，使用组织研磨仪制备心肌组织匀浆，3500 r·min-1低温(4 ℃)离心10 min(离心半径为10 cm)，取上清。MDA、H2O2和GSH水平及SOD、CAT和GSH-Px活性按照相关试剂盒说明书进行测定。

2.5 心肌组织蛋白表达水平测定

每组分别取3只小鼠的心肌组织标本，称定质量后按1∶9加入RIPA裂解液，使用组织研磨仪制备心肌组织匀浆，12 000 r·min-1低温(4 ℃)离心15 min(离心半径为10 cm)，取上清，BCA法计算蛋白浓度。取等量蛋白样品上样，采用SDS-PAGE进行分离，然后将蛋白转至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭2 h后，分别加入Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)和β-actin(1∶1000)一抗，4 ℃摇床孵育过夜，用TBST缓冲液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室温孵育2 h，ELC发光，暗室曝光，灰度值用Image-Pro Plus 6.0软件扫描测定。

2.6 数据处理

3 结果

3.1 EFNC对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响

如图1所示，与模型组比较，EFNC中、高剂量组小鼠生存时间明显延长(P<0.05，P<0.01)，具有一定的剂量依赖性。与芦丁组比较，EFNC高剂量组小鼠存活时间略长，但差异无统计学意义。因此，在后续实验中采用EFNC高剂量进行低压低氧实验。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 EFNC对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响

3.2 EFNC对低压低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活力显著升高(P<0.01)，经EFNC和芦丁预处理可以显著降低LDH、CK和CK-MB的活力(P<0.01)。

表1 EFNC对低压低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB活性的影响

3.3 EFNC对低压低氧诱导小鼠心肌组织中H2O2和MDA含量的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中H2O2和MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，经EFNC和芦丁预处理可以显著降低H2O2和MDA水平(P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；图3同。图2 EFNC对低压低氧诱导小鼠心肌组织中H2O2和MDA含量的影响

3.4 EFNC对低压低氧诱导小鼠心肌组织中抗氧化体系的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中GSH水平和SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，经EFNC和芦丁预处理可以显著提高GSH水平(P<0.01)和SOD、CAT、GSH-P活力(P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。图3 EFNC对高原缺氧小鼠心肌组织中GSH、SOD、CAT和GSH-Px的水平的影响

3.5 EFNC对低压低氧诱导小鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05，P<0.01)，经EFNC和芦丁预处理可以进一步升高缺氧小鼠心肌组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图4 EFNC对低压低氧小鼠心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

4 讨论

高原是以低压低氧为特征的极端环境，暴露其中会对包括心脏在内的多个脏器造成损伤。本试验结果表明，与对照组比较，低压低氧模型组小鼠血清中LDH、CK和CK-MB等心脏功能指标均升高。血清中LDH、CK和CK-MB水平是反映心肌细胞膜丧失完整性的定量指标，其水平的升高提示低压低氧影响了心肌细胞膜的完整性，造成了心肌损伤[11]。有报道指出，甘松挥发油能够降低心肌缺血再灌注大鼠血清中CK-MB和心肌肌钙蛋白(cTnT)水平，具有较好的心肌保护作用[12]。与前期的结果类似，EFNC预处理能显著降低低压低氧小鼠血清中LDH、CK和CK-MB水平，提示EFNC能够维持心肌细胞膜的完整性，从而减轻心肌细胞损伤。

高原缺氧诱发心肌损伤的机制尚不完全明确。一个被普遍认可的观点认为，氧化应激在其中发挥着重要作用[13]。低压低氧能够诱导细胞和组织中活性氧(ROS)的蓄积[14]，过量的ROS能够与生物膜中的脂肪酸发生反应，诱发脂质过氧化，从而改变生物膜的功能；也能够攻击DNA和蛋白质，造成DNA损伤和蛋白质结构改变，进而对细胞造成损伤[15]。很多研究证明，通过减轻机体氧化应激水平，提高抗氧化能力，能够减轻高原缺氧损伤[16]。本实验结果显示，低压低氧模型组小鼠心肌组织中H2O2和MDA含量较对照组显著升高。H2O2是ROS的重要成员，其含量代表了ROS的水平。MDA是脂质过氧化的终产物之一，其含量与脂质过氧化水平呈正相关，能够间接反映组织的损伤程度。而给予EFNC预处理能够显著降低心肌组织中H2O2和MDA水平，说明EFNC能够通过抑制低压低氧诱导的自由基蓄积和脂质过氧化，缓解心肌组织损伤。

Nrf2是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者[19]。正常生理情况下，Nrf2与Keap1蛋白结合存在于细胞质中，通过靶向蛋白酶降解而保持Nrf2的低转录活性。ROS或亲电子基团能够促进Nrf2与Keap1中解离，游离的Nrf2从细胞质中转移到细胞核，从而调控包括HO-1在内的一系列抗氧化酶基因的表达[20]。HO-1是一种限速酶，可催化血红素降解为一氧化碳、胆绿素和Fe2+等内源性保护物质从而发挥抗氧化应激作用[21]。最新研究表明，甘松能够通过激活Nrf2/HO-1途径抑制脂多糖诱导巨噬细胞的炎症反应和氧化应激[22]。本实验结果表明，低压低氧条件下，心肌组织中ROS的产生增加，导致Nrf2和HO-1水平上调，通过激活Nrf2/HO-1信号通路应激性的抵抗低压低氧诱导的氧化应激。经EFNC预处理能够进一步上调Nrf2和HO-1的表达，提示EFNC对低压低氧诱导心肌组织损伤的保护作用可能部分是通过激活Nrf2/HO-1信号途径介导的。

综上所述，EFNC对高原缺氧小鼠心肌组织的保护作用机制与其清除过量自由基、激活Nrf2/HO-1信号途径、缓解机体氧化应激有关。