不同规格青皮饮片指纹图谱△

陈芳，梁月仪，童培珍，王利伟，刘晓霞，孙冬梅，李国卫

广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244

青皮始载于《珍珠囊》，其味苦、辛，性温，具有疏肝破气、消积化滞的功效，用于治疗胸胁胀痛、疝气疼痛、乳癖、乳痈、食积气滞、脘腹胀痛等病症[1]。《中华人民共和国药典》2015年版规定，青皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。其中收载了“个青皮”与“四花青皮”2种规格，5—6月收集自落的幼果，晒干，习称“个青皮”；7—8月采收未成熟的果实，在果皮上纵剖成4瓣至基部，除尽瓤瓣，晒干，习称“四花青皮”[2]。青皮的主要成分有挥发油类、黄酮类、生物碱类，其中黄酮类成分包括橙皮苷、橘皮素、川陈皮素等，是青皮的主要药效物质基础[3-7]。现代药理研究表明，青皮具有调节肠胃功能、去痰平喘、利胆、治疗乳腺增生等作用[8-11]。

2种规格的青皮在功能主治和成分组成上略有不同。个青皮以破气化滞为主，四花青皮以调肝理气为主。根据现有文献报道[12]，个青皮与四花青皮在橙皮苷、辛弗林、N-甲基酪胺、挥发油的含量上均有差异，多种因素对不同生长发育阶段活性成分的积累具有一定影响。本研究对比分析了2种规格青皮的指纹图谱，为不同规格青皮的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Vanquish型超高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；ME204E型万分之一分析天平、XP26型百万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS28型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(默克股份有限公司)。

1.2 试药

对照品辛弗林(批号：110727-201608，纯度：99.9%)、橙皮苷(批号：116721-201617，纯度：96.1%)为中国食品药品检定研究院提供；对照品芸香柚皮苷(批号：14259-46-2，纯度≥98%)、川陈皮素(批号：150921，纯度≥98%)、橘皮素(批号：151021，纯度≥98%)为成都普菲德生物技术有限公司提供；甲醇为分析纯；乙腈、甲酸为色谱纯；水为超纯水。

11批四花青皮饮片和11批个青皮饮片经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮，存放于广东一方制药有限公司，见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水为流动相B，梯度洗脱(0～2 min，1%～8%A；2～5 min，8%～13%A；5～12 min，13%～19%A；12～13 min，19%～22%A；13～20 min，22%～35%A；20～21 min，35%～51%A；21～30 min，51%～54%A)；检测波长：275 nm；流速：0.30 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取芸香柚皮苷、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素、辛弗林对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成各含芸香柚皮苷84.7 μg·mL-1、橙皮苷78.5 μg·mL-1、橘皮素88.85 μg·mL-1、川陈皮素85.7 μg·mL-1、辛弗林85.3 μg·mL-1的混合对照品溶液。

表1 青皮饮片样品信息

2.3 供试品溶液的制备

取本品细粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，取出，放冷，再称定质量，用10%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1专属性试验 取青皮饮片(S01)供试品溶液、对照品溶液、空白溶剂(10%甲醇)依次进样检测，考察实验方法的专属性。结果表明，样品中各个色谱峰不受空白溶剂的干扰，其中辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的保留时间与对照品色谱峰的保留时间一致，表明该方法具有良好的专属性。见图1。

注：A.混合对照品溶液；B.空白试剂；C.供试品溶液；1.辛弗林；3.芸香柚皮苷；4.橙皮苷；6.川陈皮素；7.橘皮素；图2～3同。图1 个青皮饮片指纹图谱专属性考察UPLC图

2.4.2精密度试验 取同一青皮饮片供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，以橙皮苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.04%～3.25%、0.48%～2.48%，表明分析方法精密度良好。

2.4.3重复性试验 平行制备6份青皮饮片(S01)供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，以橙皮苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.02%～1.36%、0.53%～1.79%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4稳定性试验 取青皮饮片(S01)供试品溶液，分别于制备后0、2、6、11、15、18 h，按2.1项下色谱条件测定，以橙皮苷为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.04%～2.75%、0.42%～2.95%，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立及分析

2.5.1共有模式及共有峰的确定 按2.3项下方法制备供试品溶液，根据已建立的特征图谱方法对各批次供试品溶液进行测定，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012 版)，以平均数法得到青皮饮片指纹图谱共有模式，匹配到7个稳定的共有峰，且分离度较好，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为青皮饮片的指标成分群。因此，确定这7个峰为青皮饮片的共有峰。在15.73 min处的为橙皮苷色谱峰，橙皮苷峰分布正态，达到基线分离，且峰面积较大，所以确定为参照峰。以4号峰橙皮苷峰为参照峰，不同规格青皮饮片各批的共有峰的相对保留时间、相对峰面积见表2～3，指纹图谱的叠加图见图2～3。

2.5.2不同规格的青皮指纹图谱相似度评价 采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，以青皮饮片生成的共有模式作为参照图谱，分别计算个青皮、四花青皮相似度，结果见表4。各批次个青皮的相似度为0.927～1.000、四花青皮的相似度为0.953～1.000，表明个青皮、四花青皮质量稳定，成分组成差异小。

表2 青皮饮片样品 UPLC 指纹图谱分析结果(相对保留时间)

表3 青皮饮片样品 UPLC 指纹图谱分析结果(相对峰面积)

图2 个青皮饮片样品UPLC指纹图谱叠加

图3 四花青皮饮片样品UPLC指纹图谱叠加

2.5.3不同规格青皮饮片各特征峰峰面积差异分析 运用SPSS 20.0软件对不同规格青皮饮片各特征峰峰面积进行独立样本检验，各特征峰峰面积见表5，检验结果见表6，显示峰1、峰5、峰6、峰7峰面积差异具有统计学意义(P<0.05)，说明不同规格青皮饮片其成分的组成基本上是一致的，但是成分含量比例存在差异。

3 讨论

本实验的样品分别采自浙江、湖南、湖北、江西4个产地，个青皮与四花青皮都具有7个特征峰，相似度均大于0.85，说明不同规格青皮饮片其成分的组成基本上是一致的。说明不同生长期的青皮，遗传因子相同，生长期不同即环境因子、气候因子、光照不同，其所含主要化学成分种类相近。药用植物是中药资源的主体，次生代谢产物为其主要活性成分，不同生长时期，其代谢主要活性成分含量比例不同。个青皮与四花青皮成分含量存在差异，与产地、生长时期、采收期、加工方法等因素有关，有待深入研究。

在有关文献的基础上，采用二极管阵列检测器(DAD)对青皮供试品溶液进行紫外扫描(190～400 nm)，分别比较230、284、275、320 nm波长下的色谱图，发现275 nm波长下整体性峰形较好、吸收强、色谱峰数较多且各峰之间的分离度较好，能够全面反映青皮的物质基础。故选者275 nm作为指纹图谱最佳波长[13]。同时考察了不同流动相(乙腈-0.5%冰乙酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液、0.1%甲酸溶液)，选择乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相并对洗脱梯度进行优化，以达到较好的峰形及分离效果。同时对不同柱温、不同色谱柱等色谱条件进行筛选优化，最终确定2.1项下色谱条件。此外，对样品的提取溶媒、提取方式、提取时间和溶媒用量进行考察，确定供试品溶液的制备方法。建立的方法简单、高效，可用于青皮饮片的质量评价。

表5 青皮饮片各特征峰峰面积

表6 不同规格青皮饮片各特征峰峰面积独立样本检验

本实验采用UPLC建立青皮指纹图谱，对共有峰进行指认，对不同规格青皮指纹图谱特征峰进行差异分析。采用对照品指认了峰1为辛弗林，峰3为芸香柚皮苷、峰4为橙皮苷、峰6为川陈皮素、峰7为橘皮素，峰3、4、6、7为黄酮类成分；采用独立样本检验，结果显示，不同规格青皮饮片其峰1、5、7峰面积差异具有统计学意义(P<0.05)，个青皮中辛弗林、川陈皮素、橘皮素峰面积均高于四花青皮，表明不同规格的青皮在辛弗林、川陈皮素、橘皮素等成分的含量存在差异。文献研究报道，从幼果期到成熟期，青皮中辛弗林的含量均呈现递减的变化趋势，总黄酮的含量随果实成熟度的增加呈现降低的趋势[12，14-15]。本研究结果显示，个青皮中辛弗林高于四花青皮，与文献报道一致。这些说明青皮的生长发育时期，物质形成不是简单的从少到多，而是随着生长发育，有些成分减少，有些成分增加。这与其在植物体内的代谢转化过程相关，多种因素对不同生长发育阶段物质成分的积累具有一定影响。个青皮、四花青皮有效物质含量存在差异，与其临床应用有所侧重相一致。因此，建议在质量标准中个青皮、四花青皮可建立相同的含量测定指标，但标准范围应当不同，以期有针对性地控制不同规格青皮质量。