多糖的口服吸收研究进展

章柏钰，涂晶晶，刘萌萌，周本宏，2*

1.武汉大学 人民医院 药学部，湖北 武汉 430060；2.武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072

多糖是由多个单糖残基通过糖苷键连接成的生物大分子[1]，广泛存在于高等植物、藻类、真菌、细菌等生物体中，作为能源供应原料、生物膜组成成分以及细胞壁支撑材料。值得注意的是，与其他生物大分子(如核酸、蛋白质)相比，多糖的结构更加复杂。比如，核酸中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸只能以一种特定的键合方式连接，而多糖中的单糖可以在不同位点上进行连接，形成广泛的分支或线性结构。这种复杂的连接方式提示多糖可能会承载更多的生物信息[2]。由于这种结构的复杂性，使糖类化合物的研究进展速度远远不及蛋白质、核酸等其他生物大分子。

口服给药是目前药物制剂中应用最为广泛的给药方式之一。口服给药属于非侵入性给药方式，方便、安全、成本低、患者依从性高。目前，上市的多糖类药物的剂型主要以口服剂型为主。据统计，卫生部(现国家卫生健康委员会)药品标准中药成方制剂、国家中成药标准汇编和中国食品药品监督管理局中的中药保护品种库共收载了27个含多糖的中成药，其中22个制剂为口服剂型[3]。国内外的科研人员已经对天然多糖的提取工艺、化学结构与药理活性等方面开展了大量研究[4-8]，单糖组成、糖苷键连接方式、所带电荷、相对分子质量大小等皆不同的活性多糖，均能通过口服的方式发挥广泛的生物学活性。但是，对多糖口服吸收难易程度如何、是以原型形式还是降解形式被吸收、何种转运方式介导其吸收过程等问题的研究甚少[9]，仍缺乏对体内多糖代谢的认识。本研究就近年来有关多糖的生物活性、口服吸收过程及体内研究方法等方面进行综述，为糖类中成药的安全性和有效性提供参考。

1 多糖的生物学功能

随着20世纪糖生物学的快速发展，国内外学者开始发现多糖及其复合物的一些新应用。一些具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调血脂、抗凝血、调节肠道菌群等[10]功能的天然活性多糖可以开发成各种保健品和药物。恶性肿瘤是世界上发病率最高且难以治愈的疾病，常用的化疗药物不良反应强、易产生耐药性。于是，具有抗肿瘤活性、安全无毒的天然活性多糖受到了研究者的关注。目前，部分对癌细胞增殖有很强抑制作用的生物活性多糖，如香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖等，已作为抗肿瘤药物应用于临床。还有一些多糖可以作为免疫调节剂与化疗药物联用，增强机体的免疫力和化疗药物的抗肿瘤活性。有研究表明，当归多糖(cASP)可以通过上调过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)，激活脂联素-沉默信息调节因子1-腺苷酸活化蛋白激酶(adiponectin-SIRT1-AMPK)通路，减轻血清和肝脏中的脂质失调，并且通过调节与糖代谢相关的酶类，激活磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路降低血糖水平，改善胰岛素抵抗[1]。随着藻酸双酯钠(PSS)作为治疗心血管疾病的第一类海洋多糖类药物应用于临床，人们开始关注海洋多糖的研发，并发现其在抗肿瘤、免疫调节、降血糖、调血脂、抗病毒、抗菌等方面均有作用。目前，一些海洋多糖已经进入临床研究，如抗艾滋病药物聚甘古酯(911)、抗脑缺血药物D-聚甘酯。PSS作为新型肝素类海洋生物药物，具有抗凝、抗血栓的作用，在心脑血管疾病、高血糖、高血脂、肾病等方面均有应用[11]。迄今为止，许多慢性疾病，如糖尿病、高脂血症、炎症性肠病，已被证明与微生物成分的改变有关[12]。有研究显示，人参多糖可以改善硫酸右旋糖酐钠(DSS)诱导肠道菌群失调为特征的结肠炎模型，恢复肠道的菌群平衡，同时还可以增强人参皂苷的肠内暴露，增加生物活性分子的吸收[13]。肝素、肝聚糖可以增加肠道菌群中乳酸菌的数量，有助于调节肠道感染，是一种有效的肠道菌群调节剂[14]。大粒车前子多糖可以调节肠道菌群的组成，并降低小鼠血清和肝脏脂质、血糖的水平[15]。现代食品工业中，琼脂、海藻酸钠、卡拉胶等多糖作为食品添加剂被广泛应用。有研究表明，目前世界上有30种以上的多糖正在进行抗肿瘤、抗病毒以及糖尿病治疗等方面的临床研究[16]。一部分活性多糖已经作为药物应用于临床，如肝素类药物、硫酸软骨素、降糖药物阿卡波糖和一些多糖类疫苗等。应用于医药领域的代表性多糖药物见表1。除此之外，天然多糖安全无毒、水溶性高且生物相容性较好，并且有些多糖在体内有特异性靶点，可以作为某些药物输送系统的载体[17-18]。如共价交联有机磷衍生物和壳聚糖，可制备成包含喜树碱的水凝胶口服给药系统，水凝胶的黏附特性可延长药物在胃肠道中的停留时间，能够以恒定的低质量浓度释放喜树碱，避免载体饱和，降低肠道毒性[19]。根据相关的药理活性报道可以发现，多糖可以广泛地调节机体的各种代谢。关于多糖口服吸收的生物功能见表2。

表1 应用于医药领域的多糖药物

表2 口服多糖的生物功能

2 多糖的口服吸收方式

在过去的几十年里，科研人员对碳水化合物的消化和吸收进行了大量的研究。传统观念认为，肠腔中存在的水解酶和成熟肠上皮细胞刷状边缘的一系列碳水化合物酶能够将多糖水解成低聚糖，多糖口服后主要以单糖的形式运输穿过肠道上皮。但是，人类缺乏许多活性多糖糖苷键裂解所需的糖苷水解酶和多糖裂解酶[42]，而肠道细菌存在编码这些酶的基因，肠道是多糖口服后的必经之路，于是科研人员将肠道菌群与多糖联系起来，研究多糖的微生物代谢与生物学活性的关系。还有一些研究人员用荧光染料标记多糖，发现多糖可以以原型形式吸收而不被胃肠道降解。目前，关于多糖的口服吸收方式有以下3种理论：直接吸收、通过肠道微生物群或通过派尔集合淋巴结(Peyer patch)吸收[12]。

2.1 通过小肠直接吸收

虽然多糖相对分子质量较大，经过肠壁时会遇到一系列屏障，但仍有相关研究证实多糖能通过肠壁吸收入血。肠黏膜表面积较大，富含丰富的小肠绒毛和肠毛细血管，并且胃肠道中存在转运体，这些结构特征有助于营养物质吸收入血。Wang等[43]通过尤斯灌流室(Ussing chamber)模型、结扎肠循环模型和近红外示踪法研究cASP的口服吸收能力，发现其在回肠段吸收最好，表观渗透系数(Papp)为4.56×10-6cm·s-1，推测回肠中高度表达的胆汁酸转运体可能起到了运输作用。同时，通过Caco-2细胞研究其吸收机制发现，cASP的转运是由巨胞饮、网格蛋白等大分子内吞途径介导的，并且具有时间和能量依赖性。Zhang等[44]用异硫氰酸荧光素(FITC)标记硫酸岩藻多糖硫酸酯，对大鼠进行单向肠灌流，发现硫酸岩藻多糖硫酸酯的最佳吸收部位为空肠，其次为回肠，最后为十二指肠；并利用Caco-2细胞研究硫酸岩藻多糖的吸收机制，结果表明，岩藻多糖硫酸酯的吸收是通过网格蛋白介导的。Wang等[45]利用Caco-2细胞模型研究了灵芝多糖(GLP，赤灵芝Ganodermalucidum)的吸收转运机制。激光共聚焦结果显示，GLP可以被细胞核吸收。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析表明，低质量浓度GLP(50 μg·mL-1)由葡萄糖转运载体(SGLT)1介导转运吸收，高质量浓度GLP(100 μg·mL-1)由SGLT2介导转运吸收。贾晓燕[46]利用Caco-2细胞研究荧光标记的氨基多糖(f-Ap)和纳米化氨基多糖(f-ApN)的肠吸收能力。首先在荧光显微镜下可以观察到f-Ap主要存在于细胞间隙，f-ApN可以透过细胞膜被细胞摄取。随着质量浓度的增高，纳米化氨基多糖(APN)的转运达到饱和；并且氨基多糖(AP)和APN的转运不受温度的影响。由此推测f-ApN吸收机制主要是跨细胞易化扩散，f-Ap是通过细胞旁路途径吸收。Ren等[47]利用Caco-2细胞模型研究了猴头菌多糖(HEP)的吸收转运，通过比较顶端(AP)、底端(BL)侧的Papp发现，HEP是通过被动转运经肠道吸收入血。

上述研究表明，多糖能够直接通过小肠吸收，但不同来源的多糖的优势吸收肠段、吸收能力、吸收方式不尽相同。被动转运、主动转运、胞吞胞吐或细胞旁路途径等均能介导多糖的吸收，故在评价多糖在肠道上皮吸收途径的方法时，需考虑其转运是否由多种转运方式共同参与并找到最为主要的转运方式。

2.2 肠道菌群介导多糖的吸收

有研究发现，有些多糖经过灌胃给药后，在小鼠的血液、组织中均不能检测到多糖分子，但可以观察到肠道中菌群成分的改变，于是推测这些多糖不经小肠吸收，而是被富含微生物菌群的盲肠、结肠发酵成短链脂肪酸(SCFA)，通过调节与生物活性相关的肠道微生物群发挥各种生物学活性。Li等[48]通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和FITC标记的近红外示踪法，研究铁皮石斛多糖(DOP)的口服吸收过程。结果表明，口服DOP基本不能被肠道吸收，而是通过盲肠降解成乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸等SCFA，调节与小鼠4T1肿瘤生长抑制有关的肠道菌群。Ai等[49]为了明确鲍鱼硫酸多糖(AGSP)的作用机制，首先在体内和体外模型中评估了其代谢特性。结果表明，AGSP不易被吸收入血，大部分通过粪便排出体外，AGSP在体内的各种生物活性主要来源于肠道菌群组成的调节，而非直接作用于远离消化道的机体器官。Ding等[50]研究灵芝多糖(PSG，黑灵芝G.atrum)在体内外的消化和发酵行为。体外模拟胃肠消化过程中PSG的相对分子质量降低，但未产生游离单糖。通过测定了人粪菌群对PSG发酵的影响发现，粪便接种液的pH下降，总SCFAs、乙酸、丙酸和丁酸的质量浓度在体外发酵过程中均有显著提高。这些结果表明，PSG在上消化道不能完全降解，但在大肠中可以被分解利用。

肠道微生物菌群的变化可以影响体内某些代谢物，进而影响一些疾病的发生与发展。现有研究表明，口服多糖经过肠道微生物发酵，通过改变肠道微生物组的物种组成而发挥某种作用。

2.3 通过Peyer patch吸收

大量研究表明，肠黏膜不仅仅在营养物质的消化与吸收中起作用，也参与了抵抗肠道病原体、增加肠黏膜免疫、保护肠道屏障的过程[14]。肠组织中富含淋巴细胞，在小肠(主要是回肠末端)的肠系膜侧黏膜下层存在多个滤泡集合的小块淋巴组织，称为Peyer patch[13]。Rice等[51]用Alexa Fluor 488荧光标记葡聚糖，在流式细胞仪下检测到葡聚糖能被Peyer patch识别并结合，于是笔者推测，多糖的吸收可能涉及Peyer patch的摄取。多糖通过口服进入肠道后，会触发免疫反应，被免疫细胞吞噬进入淋巴循环。目前，有关Peyer patch介导多糖吸收的报道并不多。相关研究发现，无菌动物的肠道相关淋巴组织发育不完善，存在明显的免疫缺陷[52]。这说明肠道微生物菌群可能参与了淋巴组织的成熟，但具体的参与机制需要更深入的研究。

3 研究多糖口服吸收的模型

口服吸收的主要障碍包括胃肠道环境的酸碱性、酶、大部分胃肠道的黏液层以及上皮细胞的紧密连接[53]。尽管存在这些障碍，肠上皮也具有一些优势，比如肠壁表面积大且血管丰富，并且存在肠道微生物菌群、Peyer patch等。这些因素对药物的口服吸收都有一定的促进作用。目前，用于研究多糖的口服吸收模型包括体外消化模型、动物模型和细胞模型[54]。体外消化模型是模拟口腔、胃和肠道条件来研究多糖在消化道内的消化和代谢。该方法能够模拟肠道微环境，更加真实地反映药物的吸收情况，简单、经济且重现性好。动物模型包括体外模型(如外翻肠囊法、肠襻法、体系法)、体内模型(如肠灌流)和在体模型(如近红外荧光示踪法、同位素示踪法)。该方法直接在活体组织上进行试验，结果真实可靠。细胞模型主要包括Caco-2细胞模型、犬肾上皮连续细胞系(MDCK)细胞模型等。细胞模型可以构建肠上皮细胞的结构，分泌相关的酶和转运载体，主要用于研究药物的口服吸收机制。在研究药物的吸收过程时，不能单用其中一种研究模型，而是要联用多个模型，这样得出的结果会更加可靠。

4 多糖的口服吸收的含量测定方法

多糖是由碳、氢、氧等元素构成的一种相对分子质量较大的碳水化合物，缺乏特征的官能团，经口服吸收入血的含量极低且内源性糖类对多糖的测定也会产生一定的干扰，因此多糖在生物样品中的定量检测技术是研究多糖口服吸收的关键。目前使用的方法有：比色法、生物测定法、免疫学测定法、同位素标记法、高效液相色谱法和荧光标记法。

4.1 比色法

比色法是用于多糖含量测定的经典方法，包括苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法[55]。其原理是先用硫酸将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚或者蒽酮显色，测定吸光度。目前，苯酚硫酸法使用较多。Wang等[45]以5 mg·mL-1剂量的GLP灌胃小鼠，分别于不同时间点取小鼠各肠段组织和血液，通过苯酚硫酸法测定多糖的含量，探究灵芝多糖在各肠段的吸收情况。虽然体内一些内源性的代谢物可能会干扰多糖的定量，存在一定的误差，但是比色法方便简单，显色稳定，可作为其他方法的补充。

4.2 生物测定法

生物测定法利用目标物质能引起机体、组织或细胞产生某种特异性反应，通过该反应产生的量效关系间接对目标物质进行定量的分析方法。如某些糖类生物大分子具有抗凝血、抗炎等生物活性，通过检测相关的凝血因子或者炎性因子指标的变化情况，间接对多糖含量进行测定。齐云等[56]联合生物测定法和Caco-2细胞模型评价肉苁蓉多糖(CDPS)的吸收能力。CDPS能刺激RAW264.7细胞分泌一定量的一氧化氮(NO)，通过测定NO的含量，间接对CDPS进行定量，结果显示，CDPS是一种吸收不良的多糖。生物测定法需要找到一个足够灵敏的指标才能保证实验的准确性，但是生物反应往往是一个复杂的过程，会受到各种因素的干扰，使用具有局限性。

4.3 免疫学测定法

免疫学测定法是以抗原-抗体间的特异性反应为基础，对目标物质进行定量的一种方法，包括免疫放射定量法、放射免疫法和酶联免疫法。前2种方法是将抗原抗体特异性结合与同位素标记技术联用，利用放射计数法对被测物质进行定量分析。酶联免疫印迹法(ELISA)的原理前2种相似，但是不需要进行同位素标记，而是用可以与底物发生显色反应的酶来标记。与前2种方法比较，ELISA法简单、安全、不具有放射性。Irhimeh等[57]利用一种新的抗硫酸多糖抗体，采用ELISA法测定人口服岩藻聚糖硫酸酯后血清中多糖分子的含量，结果表明，岩藻聚糖硫酸酯能够通过肠道吸收入血，吸收率约为0.6%。聚甘古酯(911)是从褐藻中提取得到的一种海洋硫酸多糖类物质，相对分子质量较小、免疫原性较弱，无法作为抗原诱导抗体生成。陈騉等[58]将911与白蛋白(HAS)进行共价连接，增加其免疫原性，然后采用ELISA法对其进行定量。免疫学测定法的缺点在于不能分辨原型物质与代谢物且体内内源性的大分子有可能干扰抗原抗体结合，产生的结果有一定误差。

4.4 同位素标记法

根据是否具有放射性，可以将同位素分为放射性同位素和稳定性同位素。放射性同位素(99mTc、35S、3H、125I)能够自发地发射特征射线，可以利用核探测器、电子计算机断层扫描(CT)等技术对其进行定量、定位检测。该测量方法简便易行且灵敏度高。稳定性同位素(2H、13C、15N、18O)结构稳定，不能自行衰退，所以不存在半衰期的问题，相对安全，常用于药理药效方面的研究，而且可以通过质量数的差别，利用质谱区分目标化合物和未标记化合物[59]。但是，其灵敏度不及放射性同位素且成本较高，目前放射性同位素示踪法应用较多。高其品等[60]用3H标记银耳多糖，以20 mg·kg-1的剂量灌胃大鼠，分别在不同部分时间点测定血液的放射性，对药物进行定量，测定其药时曲线。舒亚民[61]利用99mTc的放射性，对当归多糖进行标记，得到当归多糖锝标记物，使用单光子发射计算机断层成像术/电子计算机断层扫描(SPECT/CT)追踪99mTc发射的γ射线，对移植瘤裸鼠进行体内成像。该方法不仅可以对体内的药物吸收过程进行定量，还可以直观地通过CT成像观测到当归多糖的肝靶向性。任理等[59]以13C-D-葡萄糖为示踪剂，利用液质联用技术研究Caco-2细胞对葡萄糖的吸收能力。虽然同位素示踪法灵敏度高，可以实时监测药物在体内的变化过程，但是也存在一些缺陷。首先是放射性核素的安全性问题，该检测方法对操作人员和设备的要求较高；其次，对于一些半衰期相对较短的同位素，放射性衰变相当快，很难用于对时间有要求的试验中。更重要的是，目前并没有研究能够证明同位素标记法不会改变多糖的结构，且该方法无法区别体内药物是以原型形式还是降解形式存在。

4.5 高效液相色谱法

高效液相色谱法是利用不同极性的物质在两相中分配系数不同，对其进行分离、定量的方法。色谱法的优点是所需样品量少、灵敏度高且操作简单、方便，是用于物质定量的最常用的方法。目前，用于多糖定量检测的方法主要有离子交换色谱法和高效凝胶渗透色谱法。离子交换色谱法是通过改变固定相上所带的离子交换基团，对带电荷的多糖进行分离(如硫酸化多糖)；高效凝胶渗透色谱可用于分离相对分子质量不同的多糖。Li等[48]联合高效凝胶渗透色谱和电喷雾检测器，研究DOP的口服吸收过程，发现超过99.9%的DOP不被小肠吸收。Nagamine等[62]利用分子排阻色谱法联合紫外检测器对岩藻多糖硫酸酯进行分离和定量，并测定Caco-2细胞中岩藻多糖硫酸酯的转运机制。相比于前几种方法，高效液相色谱法灵敏度更高，但由于多糖结构上没有特征的紫外、荧光基团，常用的检测器(如示差折光检测器、紫外检测器、电喷雾检测器)很难检测到体内的痕量样品。

4.6 荧光标记法

荧光标记法是将多糖分子上的活性基团(如羟基、氨基、羧基等)与荧光染料以共价偶联的方式进行结合，通过检测荧光强度对多糖分子进行定性、定量研究。荧光标记后的多糖可以在荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪等荧光检测仪器下变得“可视化”，从而在细胞、组织乃至活体水平上对其进行定位检测[63]。因此，荧光标记法是一种简单、直观且高灵敏度的检测手段。常用的荧光染料有8-萘胺-1，3，6-三磺酸(APTs)、5-氨基荧光素(FLA)、FITC、2-氨基吡啶(2-AP)、菁染料(Cy)等[64]。为了检测荧光标记法的可行性，谢瑛等[64]首先分别用同位素125I和FITC标记猪血源纤维蛋白胶，观察猪纤维蛋白原在大鼠体内的吸收、组织分布、排泄过程。结果显示，FITC标记示踪法与125I标记示踪法具有一致性。之后，用FITC代替125I标记贻贝多糖(MA)，研究MA口服给药后在大鼠体内的吸收代谢过程。Wang等[43]用Cy5.5标记cASP，研究其肠吸收机制，利用Cy染料的近红外一区成像能力，对灌胃小鼠进行活体成像，更加直观地观察到cASP在体内的吸收、分布。

虽然荧光检测法简单、安全且无创，但是其无法说明药物是以原型还是代谢方式进入体内。因此，将荧光标记与色谱法结合可以进一步了解多糖的吸收方式，该方法称为衍生化色谱法，可以分为柱前衍生化色谱法和柱后衍生化色谱法。柱前衍生化色谱法是先对多糖进行衍生化标记，然后利用标记后的多糖和一些非目标物在固定相上的保留时间不同，对其进行分离，然后用荧光或紫外检测器检测目标物质。柱后衍生化色谱法是先将待测样品进行色谱柱分离，然后进行衍生化标记，最后进入检测器进行检测。柱前衍生化是手动操作的，不需要借助衍生化仪器，故衍生化试剂和反应条件是可以选择的。但是反应未除净的副产物会被带入色谱峰中，可能会干扰目标物质的分离。柱后衍生法不存在这些问题，但是对仪器要求比较高，需要配套衍生化仪器，成本较大[65]，故目前柱前衍生化色谱法使用较多。王俊等[66]以6-氨基荧光素(FA)为荧光染料标记海参硫酸软骨素，通过串联有荧光检测器与示差检测器的凝胶排阻高效液相色谱对衍生标记后的多糖进行分析。罗立等[67]用FITC标记当归多糖，利用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定大鼠体内当归多糖的含量。Zuo等[42]采用FITC的衍生物荧光素-5-氨基硫脲(FTSC)作为荧光探针，标记鱿鱼墨汁多糖。利用联合荧光检测器的分子排阻色谱，检测小鼠口服后血液和粪便中的含量。

5 结语

近年来，人们致力于从天然资源中寻找具有药理活性的物质，用于临床上某些疾病的治疗。而多糖作为自然界中广泛存在的大分子，生物学活性复杂，且安全无毒，受到了越来越多的关注。大量研究证明，多糖能够通过口服吸收发挥生物学作用，研究多糖在体内外的吸收过程对于揭示其药理作用具有重要意义。多糖的体内研究虽然取得了一些进展，但是其口服吸收方式仍存在争议。目前有关多糖能够以原型形式口服吸收入血的研究往往联用了荧光标记法，但是标记后的稳定性如何，标记是否改变了多糖原本的空间构象使其易于吸收等问题还有待商榷。肠道微生物菌群介导多糖降解后生成的发酵产物会影响相关代谢途径的观点还需提供进一步的证据。并且，肠道微生物菌群与Peyer patch之间的关系也未完全阐明。有关多糖的体内定量检测方法的研究较为薄弱，常用的同位素标记法和荧光标记法也存在一些不足之处。虽然糖类大分子的体内代谢研究的报道日益增多，但多糖的相对分子质量大，组成结构复杂，研究的深度远远不及生物碱、黄酮类小分子活性物质。大部分多糖的提取纯化工艺、表征方法的重复性不高，很难得到均匀的多糖组分，这也是体内定量检测多糖的障碍之一。总的来说，多糖的研究仍面临着巨大的机遇和挑战，这需要科研人员进一步研究与发现，阐明多糖的吸收机制与药效的关系，为多糖成药性研究提供一定的科学依据。