滇重楼地上部分总皂苷HPLC指纹图谱△

蒋维，李小辉，万近福，*，梅双喜，付小云

1.昆明医科大学 药学院/云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；3.云南白药集团创新研发中心，云南 昆明 650111；4.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

重楼Paridis Rhizoma是百合科重楼属植物，以云南、四川、贵州、福建等地的种类和资源最为丰富，主要有滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz、七叶一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara、多叶重楼P.polyphyllaSm.var.polyphylla、华重楼P.polyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara、狭叶重楼P.polyphyllavar.stenophyllaFranch.、花叶重楼P.marmorataStearn等多个品种。重楼作为传统中药材，药用历史悠久，一直以根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版收载的品种为滇重楼和七叶一枝花[1-2]。现代药理研究表明，重楼主要活性成分为甾体皂苷类化合物，具有较强的抗肿瘤、修复胃黏膜损伤、诱导血小板聚集和子宫平滑肌收缩的活性。重楼每年都可再生的地上部分一直被认为是非药用部位而被丢弃，至今未被开发利用。为了充分利用重楼地上部分植物资源，已有学者对重楼地上部位开展了化学成分及药理作用研究，证明了皂苷类成分是重楼地上部分的主要活性成分[3-4]，地上部分比根茎含有更多的皂苷元，尤其是C-22内酯和纽替皂苷元(nuatigenin)只在地上部分检测到。但重楼地上部分和根茎中均含有《中国药典》2020年版重楼“含量测定”项下的重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ等成分，说明其皂苷类成分相似但不完全相同，具有开发价值[5]。为了更好地开发和利用重楼地上部分，本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立滇重楼地上部分总皂苷的指纹图谱，并进行滇重楼地上部分、地下部分特征图谱比对，为重楼地上部分总皂苷的有效质量控制及重楼地上部分的开发利用和深入研究提供参考。

1 材料

1.1 试药

干燥滇重楼地上部分由云南白药武定种植基地提供，由云南白药集团赵庭周高级工程师鉴定，为滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz。

滇重楼地上部分总皂苷为自制，包括3批中试实验制备样品(批号分别为20190805、20190812、20190819，编号分别为S1～S3)和3批放大实验制备样品(批号分别为20190616-1、20190616-2、20190616-3，编号分别为S4～S5)；对照品重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ(批号：11590-201604)均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于94.0%；对照品重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷PA、重楼皂苷H为实验室自制，标定纯度>99.2%。

柱色谱洗脱试剂三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇为工业纯重蒸(国药集团化学试剂有限公司)；显色剂用10%硫酸乙醇溶液；水为自制超纯水；乙腈(色谱纯，Merck公司)；甲醇、无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

UltiMate 3000型高效液相色谱仪，包括LC-20AT型四元泵、SIL-20A型自动进样仪、CTO-20A型柱温箱、SPDM20A型紫外检测器(美国赛默飞世尔公司)；AG-285型电子分析天平[Mettler-Toledo(上海)有限公司]；SK8200HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；超纯水器(美国Millipore公司)；VG Auto Spec-3000型质谱仪(美国赛默飞世尔公司)；DRX-400型核磁共振仪(德国Bruker公司)。

柱色谱硅胶(80～100、200～300目)和薄层色谱硅胶G板、HPD-100型大孔树脂(青岛海洋化工有限公司)；十八烷基键合硅胶Rp-C18(40～63 μm，Merck公司)。

2 方法与结果

2.1 总皂苷制备

重楼药材(粉碎、过筛)粗粉用60%乙醇回流提取3次(共14倍量)，离心得到提取液，提取液50 ℃减压浓缩得到浓缩液，浓缩液再用HPD-100型大孔树脂柱色谱纯化(先后用40%、85%乙醇洗脱)，收集85%流分减压浓缩、真空干燥，即得。

2.2 色谱条件

采用Ecosil HPLC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)进行分离，流动相为乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脱(0～10 min，40%A；10～30 min，40%～50%A；30～32 min，50%～40%A；32～35 min，40%A)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为203 nm；柱温为31 ℃；进样量为10 μL；检测时间为35 min。

2.3 溶液的制备

2.3.1混合对照品溶液 取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷PA、重楼皂苷H对照品适量，加甲醇制成含重楼皂苷Ⅰ 72.97 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅱ 82.92 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅲ 75.30 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅳ 72.40 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅴ 64.70 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅵ 61.30 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅶ 66.30 μg·mL-1、重楼皂苷PA 68.50 μg·mL-1、重楼皂苷H 72.40 μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.3.2供试品溶液 取各批次总皂苷试药约0.15 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加85%乙醇水使溶解、定容，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验 取同一供试品溶液S1(批号：20190805)，连续进样6次，检测特征图谱，选择出峰稳定、峰面积较大、响应值最高的重楼皂苷Ⅶ为参照峰，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.26%，相对峰面积的RSD均小于1.81%，表明本方法精密度良好。

2.4.2重复性试验 取同一供试品S1(批号：20190805)6份，按2.3.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项下色谱条件检测，记录特征图谱，以重楼皂苷Ⅶ为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.31%，相对峰面积的RSD均小于1.02%，表明该分析方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验 取同一供试品溶液S1(批号：20190805)分别于0、2、4、6、8、12 h进行检测，记录特征图谱，以重楼皂苷Ⅶ为参照峰，各色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.97%，相对峰面积的RSD均小于1.22%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

将6批重楼地上部分总皂苷样品分别按2.3.2项下方法制成供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，得到各样品的HPLC特征图谱。将6批样品的特征图谱以CDF格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，以S1样品图谱为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.10 min，对色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成对照图谱(R)，见图1。共标定8个共有峰，6批所测供试品色谱图与对照图谱相似度均大于0.99。结果表明，不同批次的重楼地上部分总皂苷的化学组成十分相似。

图1 6批重楼地上部分总皂苷特征图谱和对照图谱(R)

2.6 特征图谱中未知化合物分离鉴定

2.6.1化合物分离 取3批中试重楼地上部分总皂苷各200 g，共600 g，85%乙醇水溶解，1200 g硅胶拌样。粗分划段：试药用硅胶柱色谱(乙酸乙酯-乙醇，100∶1～10∶1)梯度洗脱，得到目标峰化合物含量较高的G、F组分；G组分用硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脱，再经中压Rp-C18柱色谱(75%～100%甲醇)洗脱，得到2个亚组分，再分别重结晶、滤过结晶、收集母液再重结晶得化合物cld01(3 g)和化合物cld03(1.5 g)；F组分用硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇，20∶1～5∶1，)梯度洗脱，再用中压Rp-C18柱色谱(75%～100%甲醇)，得到1个亚组分，经重结晶、滤过结晶、收集母液再重结晶得化合物cld02(100 mg)。

2.6.2结构鉴定cld01：白色针状结晶(甲醇)。ESI-MSmz：883[M-H]-，929[M+HCOO]-；分子式为C45H72O17。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.31(1H，brd，J=5.0 Hz，H-6)，4.45(lH，dd，J=5.5，5.0 Hz，H-16)，3.85(1H，m，H-3)，3.51(2H，m，H-26)，2.28(lH，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.23(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：37.6(C-1)，30.2(C-2)，78.1(C-3)，39.3(C-4)，142.0(C-5)，122.1(C-6)，32.4(C-7)，32.3(C-8)，50.1(C-9)，37.0(C-10)，21.3(C-11)，32.1(C-12)，45.1(C-13)，53.1(C-14)，31.8(C-15)，90.1(C-16)，90.0(C-17)，17.3(C-18)，19.7(C-19)，44.9(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.1(C-23)，29.0(C-24)，30.5(C-25)，66.9(C-26)，17.4(C-27)；glc：102.5，75.6，76.5，77.7，77.2，61.5；rha′：102.4，73.4，73.0，80.0，68.3，18.6；rha″：103.1，72.6，72.9，74.0，70.4，17.9。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物cld01为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyran oside}[6]，结构见图2。

cld01：R1=OH，R2=S1cld02：R1=OH，R2=S2cld03：R1=H，R2=S1S1 =α-L-rha-(1→4)-α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-S2 =α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-图2 化合物cld01～cld03结构

cld02：白色无定型粉末。ESI-MSmz：761[M+Na]+，分子式为C39H62O13。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.84(2H，s，H-16)，4.39(1H，d，J=8.0 Hz，H-17OH)，3.97(2H，ddt，J=18.5，9.5，6.5 Hz，H-26)，3.85～3.71(2H，m，H-3)，2.21(1H，q，J=7.0 Hz，H-20)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.9(C-1)，30.4(C-2)，78.0(C-3)，39.6(C-4)，141.9(C-5)，122.0(C-6)，32.5(C-7)，31.7(C-8)，51.0(C-9)，37.6(C-10)，21.5(C-11)，32.1(C-12)，45.7(C-13)，53.6(C-14)，31.3(C-15)，90.4(C-16)，91.0(C-17)，17.5(C-18)，19.8(C-19)，45.0(C-20)，9.2(C-21)，110.5(C-22)，32.5(C-23)，29.4(C-24)，30.7(C-25)，67.0(C-26)，17.8(C-27)；glc：102.4，75.2，76.7，79.0，77.0，61.9；rha：102.9，72.4，72.9，73.9，70.6，18.0。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物cld02为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷[pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopyranoside)][7]，结构见图2。

cld03：白色针状结晶(甲醇)。ESI-MSm/z：867[M-H]-，913[M+HCOO]-，分子式为C45H72O16。1H-NMR(500 MHz，MeOD)δ：5.37(1H，dt，J=5.5，2.0 Hz，H-6)，5.17(1H，d，J=2.0 Hz，H-17)，4.84(1H，d，J=12.0 Hz，H-8)，4.57(1H，s，H-6)，4.39(2H，t，J=7.0 Hz，H-16)，3.95～3.89(1H，m，H-2)，2.30～2.20(1H，m，H-1)，1.20(3H，d，J=7.0 Hz，Me-21)，0.97(3H，s，Me-18)，0.95(3H，s，Me-19)，0.69(3H，d，J=5.5 Hz，Me-27)；3C-NMR(125MHz，MeOD)δ：37.9(C-1)，29.8(C-2)，76.7(C-3)，38.5(C-4)，141.9(C-5)，122.5(C-6)，32.5(C-7)，31.3(C-8)，51.5(C-9)，38.0(C-10)，21.9(C-11)，39.5(C-12)，40.9(C-13)，57.5(C-14)，32.6(C-15)，80.3(C-16)，61.9(C-17)，16.4(C-18)，19.7(C-19)，41.4(C-20)，14.9(C-21)，110.0(C-22)，31.3(C-23)，28.5(C-24)，30.5(C-25)，66.1(C-26)，17.5(C-27)；glc：102.5，75.3，76.7，78.9，77.0，61.9；rha′：102.4，72.9，73.7，80.6，67.9，19.7；rha″：103.2，72.9，73.0，73.9，70.4，18.5。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物cld03为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷{diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyrano side)}[8]，结构见图2。

2.6.3共有峰的归属及指认 分别取供试品溶液(S1)、9个重楼皂苷混合对照品溶液和分离得到的cld01～cld033个单体化合物加甲醇溶解制成的3个对照品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，记录色谱图，见图3～4。参照12个对照品的色谱行为及其二极管阵列(DAD)检测紫外光谱图，在图3上对各色谱峰进行指认，确认了7个成分，即重楼皂苷Ⅶ(2号峰)、重楼皂苷PA(3号峰)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(4号峰)，偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷(5号峰)、重楼皂苷Ⅱ(6号峰)、重楼皂苷Ⅳ(7号峰)、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(8号峰)。

图3 供试品溶液(S1)HPLC图

注：A.混合对照品；B～D.cldo1～cldo3；1.重楼皂苷Ⅶ；2.重楼皂苷PA；3.重楼皂苷H；4.重楼皂苷Ⅵ；5.重楼皂苷Ⅱ；6.重楼皂苷Ⅳ；7.重楼皂苷Ⅲ；8.重楼皂苷Ⅰ；9.重楼皂苷Ⅴ。图4 9个重楼皂苷混合对照品及cld01、cld02、cld03 HPLC图

3 讨论

本实验对不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液体系)进行了考察，结果表明，乙腈-水体系分离效果最好，分析时采用梯度洗脱并对不同的梯度程序进行考察。实验还考察了29、30、31 ℃ 3个不同柱温，结果表明，柱温为31 ℃时，分离效果最佳。最后分析条件确定为2.2项下色谱条件，峰分离度较好，保留时间适中。

在笔者前期对滇重楼地上部分总皂苷提取、纯化工艺研究的基础上，本实验首次建立了滇重楼地上部分总皂苷的指纹图谱，为滇重楼地上部分总皂苷的质量控制、制备和利用提供参考。