大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面氧化应激和炎症反应的影响△

凌书建，杨丽萍，陶剑光，王小飞，苏晓利，王杰

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000

烧伤是较为常见的外伤性疾病，根据损伤程度可分为Ⅰ度、Ⅱ度、深Ⅱ度和Ⅲ度，其中以深Ⅱ度烧伤最为常见，并且预后变数较大，治疗不及时或处理不当将导致烧伤创面加深而增加治疗难度。病理生理学研究发现，氧化应激和炎症反应在创面病变进展中具有重要作用，成为烧伤治疗药物研究的靶点[1-2]。大蒜素是天然存在的一种二烯丙基三硫化物，具有较强的抗氧化、抗炎等生物学活性[3-5]，但大蒜素对烧伤创面氧化应激和炎症反应是否具有抑制作用尚未见文献报道。本实验制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型并给予大蒜素进行治疗，以研究大蒜素对烧伤创面氧化应激和炎症反应的影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠150只，7周龄，体质量210～240 g，购自河北省实验动物中心，实验动物生产许可证号为SCXK(冀)2018-004；饲养环境为光照-黑暗12 h/12 h，温度(25±1) ℃。

1.2 试药

大蒜素注射液(规格为2 mL：30 mg，批号：20190224，徐州莱恩药业有限公司)；乳酸钠林格注射液(批号：20190513，石家庄四药有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、核转录因子-κB(NF-κB)、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒和末端标记法(TUNEL)试剂盒(南京建成生物技术研究所)；增强化学发光法(ECL)超敏化学发光液(美国Thermo Fisher Scientific公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 仪器

YLS-5Q型烫伤仪(天津科技发展有限公司)；CUT 4050型石蜡切片机(德国Leica公司)；CKX41型倒置光学显微镜(日本Olympus公司)；DY89-2型匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Allegra 21R型低温离心机(美国Beckman公司)；Multiskan MK-3型酶标仪(芬兰Thermo公司)；Tetra Systerm型垂直电泳槽、Power Pac Basic型转膜槽(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组

大鼠适应性饲养1周后开展实验，应用随机数字表法随机分为5组，即假手术组，模型组，大蒜素低、中、高剂量(5、10、20 mg·kg-1)组，每组30只。实验过程严格按照伦理委员会批准的实验方案进行。

2.2 模型制备与给药

制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型[6]。实验前动物禁食禁水12 h，麻醉后剃除背部毛发并用硫化钠溶液(8%)脱毛、75%乙醇消毒。假手术组大鼠立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液以抗休克处理；其余各组通过烫伤仪烫伤5 s制备模型，仪器参数设置为压力0.03 MPa、温度106 ℃，行病理学检查判断造模成功(图1，大部分真皮层细胞坏死，部分毛囊等附件残存)，立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液。造模完成后，大蒜素低、中、高剂量组大鼠分别立刻以5、10、20 mg·kg-1剂量腹腔注射给药，假手术组和模型组腹腔注射给予0.9%氯化钠溶液，注射剂量均为2 mL·kg-1，每日1次，共给药14 d。

注：A.假手术组；B.模型组。图1 大鼠创面皮肤病理切片(HE，×200)

2.3 创面组织病理学检查和细胞凋亡观察

各组随机取10只大鼠，颈椎脱臼致死，取创面皮肤组织，置于4%多聚甲醛溶液72 h固定，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)、展片后：1)行HE染色，梯度乙醇脱蜡、二甲苯透明后封片，通过倒置光学显微镜观察组织病理学改变。2)按照TUNEL试剂盒操作方法进行处理，封片通过倒置光学显微镜观察(细胞核黄褐色为阳性着色)；每张切片随机选取5个互不重叠的视野，分别计数视野内细胞总数和阳性细胞数，计算平均值，并按照公式(1)计算凋亡指数(AI)。

AI=(阳性细胞数/细胞总数)×100%

(1)

2.4 创面愈合率和含水量计算

各组随机取10只大鼠，于给药前和给药第14天后对皮肤烧伤创面进行拍照，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量创面面积，按照公式(2)计算创面愈合率。

创面愈合率=(1-未愈合创面面积/初始创面面积)×100%

(2)

采用干湿比重法测定创面组织含水量。颈椎脱臼处死大鼠，取创面组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗、滤纸拭干后称定质量，计为湿质量(W1)；置烤箱中90 ℃恒温烘烤至恒定质量，计为干质量(W2)，按照公式3计算含水量。

含水量=(W1-W2)/W1×100%

(3)

2.5 生化指标检测

取各组剩余的10只大鼠，经腹主动脉取血并离心(1500 r·min-1、5 min，离心半径为10 cm)。取血清，按照ELISA试剂盒说明处理后，通过酶标仪检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平。

大鼠取血后，经颈椎脱臼致死后，取创面组织，剪碎、加入9倍量4 ℃冷裂解液研磨匀浆，低温4 ℃离心(3500 r·min-1、10 min，离心半径为10 cm)。取上清液，按照各试剂盒依步骤处理后，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性、高锰酸钾滴定法测定CAT活性、比色法测定MPO活性、硫代巴比妥酸法测定MDA水平。

2.6 Western blotting法检测创面组织p-PI3K、NF-κB蛋白表达水平

取2.5项下制备的组织匀浆液，低温4 ℃离心(12 000 r·min-1、15 min，离心半径为10 cm)取上清，BCA法测定总蛋白含量后，依次行凝胶电泳、转聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，滴加p-PI3K、NF-κB、β-actin单抗后，4 ℃孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃振荡孵育1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜后滴加ECL显色发光，运用凝胶成像系统获得条带。以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面组织病理学改变的影响

经HE染色后观察发现，假手术组大鼠创面组织形态结构未见异常；模型组大鼠创面组织可见真皮下层组织水肿，胶原纤维肿胀、断裂，炎性细胞浸润等病理学形态结构改变；大蒜素低、中、高剂量组大鼠创面组织可见白色皮粒形成、上皮组织排列整齐，汗腺和皮脂腺结构完整、排列整齐但仍较表浅，炎性细胞浸润明显好转；其中大蒜素高剂量组效果较优，见图2。

注：A.假手术组；B.模型组；C.大蒜素5 mg·kg-1；D.大蒜素10 mg·kg-1；E.大蒜素20 mg·kg-1；图3～4同。图2 各组大鼠烧伤创面组织病理学改变(HE，×200)

3.2 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面细胞凋亡的影响

经TUNEL染色后观察发现，假手术组大鼠创面组织存在极少量凋亡细胞。模型组大鼠创面凋亡细胞数量较假手术组明显增多。而经大蒜素低、中、高剂量治疗14 d能够不同程度降低烧伤创面凋亡细胞数量，以大蒜素高剂量组最为显著，见图3。

AI计算结果表明，模型组大鼠创面组织细胞AI[(49.03±6.17)%]显著高于假手术组[(4.08±0.75)%，P<0.01]。与模型组比较，经大蒜素低、中、高剂量[AI分别为(42.04±5.27)%、(30.15±4.82)%、(22.59±4.51)%]治疗14 d能够显著降低烧伤创面细胞AI(P<0.05，P<0.01)。

3.3 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合率和含水量的影响

与模型组比较，大蒜素低、中、高剂量组大鼠创面愈合率均显著升高(P<0.05，P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠创面含水量显著升高(P<0.01)，而经大蒜素中、高剂量治疗14 d能够降低大鼠深Ⅱ度烧伤创面含水量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，结果见表1。

图3 各组大鼠烧伤创面细胞凋亡情况(TUNEL，×200)

表1 各组大鼠烧伤创面愈合率和含水量

3.4 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面组织SOD、CAT、MPO活性和MDA水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠创面组织SOD、CAT、MPO活性显著降低，且MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，经大蒜素中、高剂量治疗14 d能够提高大鼠创面组织SOD、CAT、MPO活性，并降低MDA水平，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表2。

3.5 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤后血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平显著升高(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，经大蒜素中、高剂量治疗14 d能够降低大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表3。

3.6 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面p-PI3K、NF-κB蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠创面组织p-PI3K、NF-κB蛋白表达水平显著上调(P<0.01)；与模型组比较，经大蒜素中、高剂量治疗14 d能够下调p-PI3K、NF-κB表达水平，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图4和表4。

4 讨论

烧伤破坏局部血管导致创面组织病理性缺血缺氧，诱发氧化应激和炎症反应，阻碍修复细胞的增殖、迁移而影响创面愈合[7-8]。因此，烧伤初期给予抗氧化、抗炎治疗措施，对烧伤创面恢复有积极意义。大蒜素是天然存在于百合科葱属植物大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物，具有较强的抗氧化、抗炎活性。本实验采用压力0.03 MPa、温度106 ℃持续作用5 s的方法制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型并腹腔注射大蒜素进行研究，发现大蒜素能够改善烧伤创面组织病变、提高创面愈合率、抑制创面细胞凋亡，提示其对深Ⅱ度烧伤大鼠烧伤创面愈合具有促进作用。

表2 大蒜素对大鼠深Ⅱ度烧伤创面组织SOD、CAT、MPO活性和MDA水平的影响

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平

图4 各组大鼠烧伤创面p-PI3K、NF-κB蛋白表达

表4 各组大鼠烧伤创面p-PI3K、NF-κB蛋白表达

烧伤创面氧供不足导致活性氧(ROS)大量生成，抗氧化酶(SOD和CAT)过度消耗导致ROS代谢不及时而蓄积，为氧化应激反应提供了物质基础[9]。SOD是体内唯一以ROS为底物的还原酶，对ROS具有高效的催化还原作用，其产物过氧化氢(H2O2)能够在CAT作用下进一步被催化还原而生成水和氧，因此SOD/CAT还原酶路径对维持ROS平衡至关重要[10]。MPO是存在于中性粒细胞中的一种过氧化氢酶，对机体清除ROS具有重要作用[11]。MDA是ROS氧化脂质产生的终产物。所以SOD、CAT、MPO活性及MDA水平能够反映氧化应激水平。本研究结果显示，大蒜素能够有效改善大鼠烧伤创面SOD、CAT、MPO活性并降低MDA水平，提示其对深Ⅱ度烧伤大鼠烧伤创面氧化应激具有抑制作用。

烧伤能够刺激促炎介质大量释放，包括IL、TNF等，其中IL-1β和TNF-α是触发炎症级联反应的主要介质[12]；并且IL-1β和TNF-α作为趋化因子能够进一步促进IL-1β和TNF-α释放；此外IL-1β水平升高能够刺激另2种炎症细胞因子IL-6、IL-8表达水平上调[13-14]，从而诱发炎症级联反应。本研究结果显示，经大蒜素治疗能够有效降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，提示大蒜素对深Ⅱ度烧伤大鼠炎症反应具有抑制作用。

PI3K由脂类和丝氨酸/苏氨酸激酶组成，p-PI3K能够通过其靶基因表达和活化而间接参与调节细胞生长、细胞凋亡、炎症反应等多种生物活动[15]。NF-κB进核后能够作为转录因子而促进 TNF-α、IL-6等炎症因子的释放而激发炎症反应，但p-PI3K参与NF-κB核转位的调控[16]，所以p-PI3K/NF-κB信号通过对炎症反应调控具有重要作用。本研究结果显示，经大蒜素治疗能够有效下调p-PI3K、NF-κB蛋白表达，提示大蒜素抑制p-PI3K/NF-κB信号通路可能是其抑制深Ⅱ度烧伤大鼠炎症反应的分子机制之一。

综上所述，大蒜素能够通过抑制氧化应激、炎症反应而促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合，其机制可能与改善抗氧化酶活性、抑制p-PI3K/NF-κB信号通路有关。