H P L C双波长法同时测定舒肝止痛丸中芍药苷和黄芩苷的含量

齐喜红，高 萌，贺 凯，张芦燕，王 庆

（宁夏药品检验研究院，银川 750001）

舒肝止痛丸全方由当归、白芍、木香和黄芩等十八味药组成，具有疏肝理气、和胃止痛的功效，用于治疗肝胃不和、肝气郁结等症状。原标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册[1]，标准中只对部分药材进行了显微鉴定。有文献[2-3]采用HPLC法对处方中芍药苷或黄芩苷一种成分进行了含量测定。为了避免单指标的含量测定控制其质量的片面性，经查阅相关文献[4-7]，本文建立了HPLC法同时测定芍药苷和黄芩苷的含量，以期为有效控制舒肝止痛丸的质量提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，梅特勒-托利多XS205电子天平均购自中国药品生物制品检定研究院。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201136）、黄芩苷对照品（批号：110715-201117）均购自中国药品生物制品检定研究院。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水为高纯水，乙醇为分析纯。6批舒肝止痛丸样品均为太极集团重庆中药二厂有限公司 生 产（批号：1011025、1112026、120407、100716、1108020、110614）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别取芍药苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含60μg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取本品适量，除去包衣，研细，取约0.5 g，精密称定。精密加入稀乙醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率40 HZ），放冷，再称定重量。用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

2.3 阴性溶液的制备

按舒肝止痛丸处方比例，制备缺白芍、赤芍、黄芩的阴性样品，按2.2项下方法，制得阴性对照溶液。

2.4 色谱条件

以Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表1。流速为1.0 mL·min-1；波长230 nm（芍药苷）、280 nm（黄芩苷）；进样量为10μL。

表1 梯度洗脱程序

2.5 专属性试验

按2.4项下的色谱条件，测定对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液。结果表明，供试品色谱中，检出与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，而阴性对照在相应保留时间无干扰，表明建立方法专属性良好，见图1、图2、图3。

2.6 线性关系的试验

精密称取芍药苷对照品13.59 mg，黄芩苷对照品13.36 mg，分别置于25 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取芍药苷对照品储备溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中；再精密吸取黄芩苷对照品储备溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。按上述色谱条件进行测定。以对照品质量浓度C（μg）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，得到芍药苷、黄芩苷的回归方程和相关系数分别为：A=1243.7C-0.7247，r=0.9999；A=3498.5C-7.9573，r=1。结果表明，芍药苷和黄芩苷分别在0.1087～1.0868μg·mL-1、0.107～2.138 μg·mL-1内具良好的线性关系。

图1 对照品色谱图

图2 供试品色谱图

2.7 精密度试验

精密吸取芍药苷和黄芩苷混合对照品溶液，按2.4项下色谱条件测定分析，连续进样6次。芍药苷和黄芩苷对照品峰面积的RSD分别为0.44%和0.50%，表明仪器的精密度良好。

图3 阴性对照色谱图

2.8 稳定性试验

取供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、12、24 h，进样测定，结果芍药苷和黄芩苷峰面积的RSD分别为1.5%、0.88%，表明这两种成分在24 h内具有良好的稳定性。

2.9 重复性试验

取样品（批号：1011025），按2.2项下的方法制备供试品溶液6份，按2.4项下色谱条件测定，测得芍药苷和黄芩苷的平均含量分别为3.5和4.6 mg·g-1，RSD分别为2.4%和2.8%。结果表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收试验

取已知含量的样品（批号：1011025）约0.25 g，精密称取6份，分别精密加入芍药苷对照品溶液（1.027 mg·mL-1）0.8 mL，黄芩苷对照品溶液（1.153 mg·mL-1）1 mL，按2.2项下方法制成供试品溶液，按2.4项下色谱条件测定，计算回收率。结果显示，芍药苷和黄芩苷的平均回收率分别为97.7%和99.2%，RSD值分别为1.38%和1.79%，见表2。

表2 舒肝止痛丸中芍药苷和黄芩苷的回收率试验结果

2.11 样品的测定

取6批舒肝止痛丸样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.4项下方法测定，计算样品含量，见表3。

3 讨论

通过二极管阵列检测器进行全波长扫描（190～400 nm），结果芍药苷在230 nm处有最大吸收；黄芩苷在280 nm、315 nm处有最大吸收。本次试验结合药典选择了230 nm作为芍药苷的检测波长，280 nm作为黄芩苷的检测波长。

本实验考察了乙腈-水、甲醇-水体系，结果发现乙腈的洗脱能力优于甲醇，基线平且灵敏度高，因此选乙腈作为流动相的有机相。同时为了改善峰形，提高待测组分的分离效果，比较了不同浓度的磷酸溶液，发现分离效果无明显差别，因此选用0.1%磷酸水溶液为流动相的水相。

表3 样品测定结果（mg·g-1）

根据各成分的结构和性质，本实验对比了加热回流提取法和超声提取法，发现2种方法提取率相近，考虑超声简便快捷，故实验选择超声提取法。对提取溶剂（甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇）进行考察，结果表明稀乙醇提取效率较高。

综上，本实验建立了HPLC法同时测定舒肝止痛丸中芍药苷和黄芩苷含量的方法，该方法具有操作简便、分离良好、专属性强等特点，可有效控制舒肝止痛丸的质量。