猪伪狂犬病病毒基因结构及功能研究进展

韩超逸，汤德元，曾智勇，黄 涛，王 彬，郭倩妤，廖少山，张 森，杨志刚，晏仁潭

(贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025)

猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种猪的急性传染病。PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒属，为线性DNA病毒。PRV可引起仔猪呕吐、高热及神经症状，病死率较高，母猪出现繁殖障碍，成年猪出现高热症状耐过后通常呈隐性感染[1]。因为PR传播速度快、危害大，OIE将其列为必须报告的疫病。PRV具有潜伏感染的特点，病毒经口鼻呼吸道感染宿主后，可潜伏于外周神经系统中，此时不产生新的病毒粒子，当外界条件变化引起动物应激时，PRV会被激活导致宿主向外排毒，感染猪群甚至造成PR的暴发[2]。潜伏感染这一特点是PRV难以净化的主要原因。

1 病毒结构

PRV病毒呈圆形或椭圆形，从内到外由双链DNA、20面体核衣壳、被膜、脂质双层膜形成的囊膜构成。20面体核衣壳由162个壳粒组成，其中150个六邻体，12个五邻体，衣壳直径约为110 nm～150 nm。被膜位于囊膜和衣壳之间由双层蛋白质构成，且内外组分蛋白不同。囊膜位于病毒粒子最外层，由11种糖蛋白和4种非糖蛋白组成，囊膜在PRV感染宿主细胞过程中发挥着重要作用。位于胞浆内被囊膜包裹的成熟病毒粒子直径为150 nm～180 nm，囊膜表面有长约8 nm～10 nm呈放射状排列的纤突[1]。

2 病毒基因结构及其功能

2.1 基因结构

PRV基因组为线状双链DNA，大小约为150 kb，G+C含量为74%，具有长独特区 (unique long region,UL)110 kb 、短独特区(unique short region,US) 10 kb，US区两端分别插入了大小为15 kb的末端重复序列 (terminal repeats,TRS)与内部重复序列 (internal repeats,IRS)[3]。因为UL区与US区方向可以相同或相反，所以PRV有两种异构体，并且两种异构体都具有感染力。PRV基因组复制起始位点，一个位于UL区域称为OriL，另一个称为OriS，在IRS区重复存在；PRV基因组含73个基因，67个开放阅读框，可编码70～100种蛋白质，主要包括衣壳蛋白、囊膜糖蛋白以及各种酶，但其中一半是PRV复制的非必需蛋白，因此PRV可以作为外源基因的载体[4]。近年来我国各地区都分离出了变异的PRV毒株，YE等将我国分离出的PRV毒株基因序列与欧美毒株序列进行对比，发现两者之间存在明显差异，故对PRV进行了基因分型，我国PRV属于基因Ⅱ型，欧美PRV属于基因Ⅰ型，对比欧美基因Ⅰ型，基因Ⅱ型PRV的US1基因出现了很大的突变，UL36、UL49.5、UL51基因突变率超过了10%，导致了我国PRV毒株与欧美PRV毒株出现了生物学功能差别，进口疫苗已经不能起到很好的保护作用[5]。根据PRV基因功能的不同可将基因分为结构基因、毒力基因和调节基因；根据PRV侵入宿主细胞转录先后顺序可以将其基因组分为立即早期基因、早期基因和晚期基因。

2.2 主要基因及其功能

2.2.1TK基因TK基因位于UL23区，基因全长963 bp，共编码321个氨基酸，是PRV复制的非必需基因。TK基因是PRV毒力基因之一，TK基因编码的胸苷激酶是PRV在静息细胞中复制所必需的。缺失TK基因的病毒在神经组织中潜伏感染能力减弱，但并不影响病毒免疫原性，因此TK基因可作为基因缺失疫苗的靶点基因。我国分离出的PRV变异毒株TK基因相对于gC、gE较为保守，与国外毒株同源性可达99.5%～100%，属同一分支[6-7]。因为TK基因的保守性较好，所以TK基因的生物学功能在不同的PRV毒株中具有代表性，可为抗PRV药物的研发提供参考。

2.2.2gE基因gE基因位于US区，基因全长1 740 bp，编码577个氨基酸，是PRV复制的非必需基因。gE基因是PRV的毒力基因之一，gE蛋白可以促进PRV与细胞融合，介导病毒在细胞间的扩散，缺失gE基因的PRV只能感染第一级三叉神经和调控鼻黏膜的交感神经，而不能扩散感染第二级神经节和交感神经元[8]，近年来我国部分地区分离出的PRV变异株gE基因氨基酸疏水残基和亲水残基发生了突变，这可能会影响PRV与细胞的融合[9]，gE蛋白不具有免疫原性，缺失gE基因会降低病毒的毒力但不影响PRV免疫原性，因此gE基因可成为基因缺失疫苗的研发靶点，目前临床应用的PRV疫苗基本都缺失gE基因，可以通过检测gE特异性抗体区分野毒感染和疫苗免疫。

2.2.3gB基因gB基因位于UL区，基因全长2 800 bp，编码913个氨基酸，是PRV复制的必需基因，gB蛋白是一个复合蛋白由gBa、gBb、gBc组成，是囊膜的组成成分。gB蛋白参与病毒与细胞膜的融合，也可诱导体液免疫应答。gB蛋白与三类融合蛋白类似，具有三聚体折叠，二聚体融合环，α-螺旋结构，gB蛋白以胆固醇依赖方式通过融合环与细胞膜结合[10]。gB具有良好的免疫原性，周莎莎等将JS-2012与Bartha-k61的gB基因交换，显著的改变了两个毒株的免疫原性[11]，因为gB良好的免疫原性在临床中可通过gB-ELISA检测猪群是否获得免疫保护。马震元等建立了PRV-gB-CLEIA法，45 min内即可完成检测，且具有良好的敏感性、特异性可实现抗体剂量值的定量检测，为临床gB抗体的检测提供了更高效的手段[12]。

2.2.4gI基因gI基因位于US区，基因全长1 053 bp，编码351个氨基酸，是PRV复制的非必需基因。gI蛋白是囊膜蛋白，可促进病毒在细胞间扩散。gI与gE通常以非共价键形式复合体存在，gI蛋白能促进gE蛋白在内质网中的分泌，保证gE蛋白的正确糖基化[13]，DONG等将经典株gE/gI基因与变异株互换发现gE/gI基因变异可增强PRV毒力[14]。因为gE、gI蛋白关系密切，所以临床上经常以二者的重组蛋白作为抗原研发抗体检测技术，申一兰等用昆虫杆状病毒表达系统制备了gE/gI重组蛋白纯度较高，并且具有良好的反应原性，为胶体金试纸的研发打下了基础[15]。

2.2.5gD基因gD基因位于US区，基因全长1 300 bp，编码402个氨基酸，是PRV复制的非必需基因。gD蛋白是囊膜蛋白，在PRV中高度保守并具有良好的免疫原性，gD基因是PRV吸附细胞所必需的，缺失gD基因的PRV无法感染细胞，与HSV相比PRV的gD蛋白只能与细胞表面受体Nectin-1结合，并且PRV对人源和猪源的Nectin-1受体结合能力并无差异，gD蛋白与Nectin-1受体以1∶1的比例结合，结合位点分别是N77、I80、M85、F129，其中F129位点有着决定性作用，若突变此位点病毒几乎不能侵入细胞[16]。病毒进入细胞是其感染机体的关键步骤，病毒只有进入细胞才能进行复制。gD基因是PRV吸附细胞的关键基因，通过了解gD蛋白与细胞表面受体结合的机制可为后续研发抗PRV药物提供参考。

2.2.6gC基因gC基因位于UL区，基因全长1437 bp，编码479个氨基酸，是PRV复制的非必需基因，成熟的gC糖蛋白大小为92 ku，是囊膜的组成成分。gC蛋白可与细胞表面的肝素样受体结合，介导病毒吸附细胞，但缺失gC蛋白的PRV仍对细胞有较低的感染性，此外gC蛋白具有多个抗原表位可诱导免疫应答，王一鹏对从免疫猪场发病仔猪中分离出的变异PRV进行序列分析，发现gC基因多处发生单个或连续几个碱基的置换、插入和缺失导致了gC蛋白的抗原表数目、位置、或氨基酸发生改变，国外疫苗株的抗血清对该变异毒株中和作用较差[17]，因此gC基因的变异可能是我国近年来各地出现免疫猪场PRV“返阳”的原因之一。

2.2.7IE180基因IE180基因分别位于IRS和TRS区，编码1460个氨基酸，蛋白质大小约为153 ku。IE180基因是PRV中唯一的立即早期基因，可独立发生转录。IE180蛋白累积后可启动病毒其他基因发生转录，PRV IE180蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)ICP4蛋白部分区域有很高的相似度，二者部分功能互补[18]。邓辉发现IE180 3′UTR端部分序列可形成G-四链体结构，抑制基因的转录，G-四链体配体小分子TmPyP4可稳定此结构，从而抑制PRV的早期增殖过程[19]。IE180基因转录位于PRV基因转录的开端，对于PRV的复制有着重要意义，因为这一特性IE180基因也可成为抗PRV药物研发的重要靶点。

2.2.8EP0基因EP0基因位于UL区，可编码1 230个氨基酸，蛋白分子质量约为45 ku，是PRV复制的非必需基因。EP0基因对立即早期基因IE180有反式激活作用，可促进IE180蛋白的表达，EP0蛋白可与IE180蛋白共同作用激活TK基因及gG基因的转录，EP0蛋白定位于细胞核，并且EP0蛋白的入核由Ran蛋白、输入蛋白α1、α3、β1共同调控[20]。缺失EP0基因的PRV在细胞中的复制能力会减弱，但并不影响PRV毒力[21]。目前对于EP0基因的研究较少，但不可否认的是EP0基因对于PRV基因转录具有重要意义。未来，EP0基因是如何调控基因转录，以及我国各地分离出的变异PRV毒株EP0基因是否发生变异，都应该是我们积极探讨的。

2.2.9UL21基因UL21基因位于UL区是PRV复制的非必需基因，pUL21是被膜蛋白，缺失UL21基因的PRV与野毒株相比增殖速率减慢，但在pUL21代偿性细胞上可恢复其增殖能力，外源性的pUL21可抑制NF-κB通路，且pUL21量越高抑制效果越强[22]，UL21基因也与PRV的神经浸染性有关，pUL21羧基端可与胞质动力蛋白Roadblock-1互作，使用pUL21羧基端缺失的PRV攻毒小鼠后，小鼠死亡时间延长，颈上神经节中的病毒含量显著降低[23]。相比国外疫苗毒株，我国近年来分离出的变异毒株UL21基因发生了突变，其pUL21表达水平升高，意味着变异毒株可能会产生更强的免疫抑制功能，以及神经浸染性[24]。

2.2.10UL41基因UL41基因是PRV复制的必需基因，UL41基因编码宿主关闭蛋白(vhs)，蛋白分子质量约为40 ku，PRV与HSV-1的vhs同源性为38.4%。vhs蛋白在体内外均具有核糖核酸酶活性，可降解宿主细胞的mRNA，抑制宿主基因表达。vhs可以切割IRES下游区域翻译起始因子eIF4H和eIF4B，增强其核糖核酸酶活性[25-26]。但在PRV中，vhs蛋白并不是唯一能抑制宿主基因表达的病毒蛋白，缺失UL41基因的PRV仍对宿主基因表达有显著的抑制作用，同时，缺失UL41基因也会显著减弱PRV在体内外的复制能力和感染力[27]。UL41基因编码蛋白可抑制宿主细胞基因表达，通过进一步研究vhs对哪些基因转录产生影响可为PRV对宿主细胞的作用的研究提供更多参考。

3 小结

PR因为其致病力强、传播途径多样、可潜伏感染等特点，成为危害我国猪业养殖最严重的传染病病原之一。PRV基因是其发挥生物学功能的基础，基因发生变异的同时也意味着病毒生物学功能的改变，自2011年以来我国各地陆续从接种过PRV疫苗的“返阳”猪场分离出了变异PRV毒株。这表明PRV变异并不是个例而已成为一种趋势，在这种趋势下了解PRV基因结构及基因功能，才能从“已知”得“未知”，为预测PRV变异株的生物学功能提供参考。除此之外，了解PRV基因功能，有助于疫苗及药物的研发，例如TK、gE基因是病毒的毒力基因且是病毒复制非必需的，故其可以成为基因缺失疫苗的靶点基因，通过检测是否存在缺失基因相应的抗体，还可对疫苗免疫猪及野毒感染猪进行区分。gD基因、IE180基因、EP0基因，对于PRV感染细胞以及PRV的增殖都具有着重要作用，可成为抗PRV药物研发的靶点基因。虽然目前PRV基因定位和基因功能还没有完全被报道，但随着近年来分子生物学技术的不断进步，未来对PRV基因结构及功能的研究会不断深入，为PRV的防控提供更多的参考。