非洲猪瘟血清学诊断和疫苗研究进展

栾宇轩，张 毫，王承宝*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省杨凌区职业技术教育中心，陕西杨凌 712100)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF) 是一种感染家猪和野猪的急性、烈性、高度接触性传染病，临床上以高热、皮肤发绀和脏器广泛性出血为特征，最急性型病死率达100%，被世界动物卫生组织(OIE)规定为法定报告的重大动物疫病。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，其基因组长达170 kb～194 kb，编码50余种结构蛋白，150余种非结构蛋白。根据中国科研团队首次解析的ASFV病毒颗粒结构可知，该病毒由内而外具有罕见的5层结构，依次是病毒基因组、核心壳层、双层脂膜、衣壳和外膜[1]。ASFV是唯一已知的虫媒DNA病毒，其在非洲大陆和欧洲大陆的传播媒介，主要是软蜱科中的非洲钝蜱和摩洛钝蜱。但目前ASFV在我国的传播媒介还未阐明，现有研究认为，我国的桦尖钝蜱和塔氏钝蜱是其潜在的媒介[2]。

ASF最早报道于1921年，但由于ASFV结构复杂、变异度高，具有完备的免疫逃避机制，各类疫苗的研制大多以失败告终，至今仍无获批上市的商品化疫苗。现有水平的疫苗株接种猪只后普遍存在毒力返强、持续带毒和保护性不佳等问题。因此，猪群在没有接种非洲猪瘟疫苗的前提下，血清中无ASFV特异性抗体或水平极低。血清学检测基于抗原抗体的特异性结合反应，具有高度的敏感性和特异性，并且能大规模地进行快速检测。若发现ASFV抗体阳性，则表明正在或已经发生感染，对于疫病的早期控制和扑灭具有重要意义。本文重点讨论了ASF各种血清学检测方法，以及灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒活载体疫苗的研究进展，旨在为ASF血清学检测方法的开发提供新思路，为有效疫苗的研制提供借鉴。

1 ASF血清学检测方法研究进展

1.1 ELISA检测方法

酶联免疫吸附试验(ELISA)是OIE推荐的首选血清学检测方法，其大多是以具有良好抗原性的ASFV结构蛋白为包被抗原，建立的间接检测方法。该方法具有成本低、特异性好、灵敏度高和检测速度快等优势，能够用于大量样品的自动化检测，是目前应用最广泛的检测方法。

串联p72蛋白优势抗原表位，建立间接ELISA检测方法，改良结构蛋白抗原不集中、蛋白表达量低等问题[3]。以p30重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，其血清灵敏度可达1∶1600[4]。借助21个ASFV p30蛋白的单克隆抗体，鉴定出4个含线性表位的抗原区，其中2个高度保守，可用于ELISA检测方法的建立[5]。通过优化密码子，改良在表达p54蛋白过程中易出现包涵体、丢失蛋白反应原性等问题，为ELISA诊断试剂的开发奠定了基础[6]。

1.2 胶体金免疫层析试纸条

OIE推荐的ASFV检测方法如PCR、ELISA等，一般都需限制在实验室进行。而胶体金免疫层析技术具有操作简单、检测快速、结果容易判断等优点，而且适用于现场检测，是目前广泛应用的检测方法。以抗ASFV p72蛋白多克隆抗体作为检测线，以葡萄球菌A蛋白作为质控线，建立胶体金免疫层析检测方法，其敏感性良好，最小检测剂量可达15 ng和21 ng[7]。以金颗粒标记的重组ASFV p30抗原作为检测线，以p30蛋白及其多克隆抗体作为质控线，建立金颗粒免疫层析检测方法，其敏感性和特异性分别达到了92.52%和92.00%，可与标准ELISA试剂盒[8]相媲美。用交叉引物恒温扩增技术结合免疫层析试纸条检测ASFV，该方法最低检出限度为200拷贝，与荧光定量PCR检测方法符合率极高，具有快速、特异等优势，为多通道大规模检测提供了发展方向[9]。

1.3 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光试验具有快速、敏感、高度特异的优点，利用ASFV毒株感染单层绿猴肾细胞(Vero细胞)，再通过抗原抗体反应藕联荧光素进行检测。如果检测样品为阳性，可在细胞浆中观察到特异性的免疫荧光。在ELISA检测方法不便于建立或判定困难时，可应用该方法进行检测。

1.4 荧光抗体试验

荧光抗体试验一般用作ASFV辅助检测方法，借助荧光显微镜和荧光标记抗体，检测猪脾脏、淋巴结等组织压片或超薄冰冻切片中是否含有ASFV抗原。该方法特异性和敏感性好，但对检测人员的操作要求较高，而且对亚急性和慢性感染的检测结果不够准确，已逐渐被PCR检测方法取代。

1.5 间接免疫过氧化酶试验

间接免疫过氧化酶试验应用了免疫组织化学技术，利用感染ASFV的Vero细胞与过氧化物酶藕联，可检测血清或渗出液中是否存在ASFV抗体。该方法对设备的要求低，而且敏感性和特异性不逊于ELISA检测方法，判定结果也较荧光抗体试验更为容易，但该方法能否取代ELISA检测方法和荧光抗体试验，还需要获取更多的试验数据。

1.6 免疫印迹法

免疫印迹法是基于高分辨率凝胶电泳和固相免疫测定技术发展起来的一种免疫生化杂交技术，该方法使得检测过程更加可视，提高了检测结果的准确性，可与间接免疫荧光试验共同用于确认ELISA法的检测结果。通过原核表达ASFV CP204L基因，建立一种新的免疫印迹监测系统(Rec p30-IB)，其特异性达98.75%，敏感性达100%。可检测极低量ASFV抗体蛋白的表达，而且较ELISA检测方法更为省时，缺点是需要购买昂贵的设备，增加了检测成本[10]。

1.7 其他血清学检测方法

建立一种使用干血拭子的检测方法，能够区分ASFV单纯感染和混合感染，其特异性和敏感性高于PCR检测方法[11]。针对ASFV的p72和p30蛋白，经典猪瘟病毒的E2蛋白，基于微球技术建立了鉴别诊断经典猪瘟和非洲猪瘟的血清抗体检测方法，结果表明，其灵敏度和特异性可达97.3%和98.3%[12]。用量子点标记SPA，以p73蛋白的优势表位合成多肽，分别作为质控线和检测线，建立ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条，该方法与ELISA检测方法符合率达100%，敏感性可达1∶320，可用于ASFV的快速检测[13]。结合免疫层析试纸条和重组酶聚合酶扩增技术，建立一种快速检测方法，可在38℃、10 min内进行快速检测，其准确性与PCR结果符合率达100%，为检测方法的开发提供了一种新思路[14]。

2 非洲猪瘟疫苗研究进展

虽然ASF最早发现于1921年，但疫苗的研究起步较晚，直到1967年才开始尝试研制灭活疫苗，而且均告失败。随后分离得到部分天然弱毒疫苗候选株，但普遍存在残余毒力，导致慢性感染等不良反应。伴随着基因工程的发展，重组弱毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒活载体疫苗也相继展开研究，这些疫苗的优点是可以敲除ASFV毒力基因，串联表达多种病毒蛋白，起到增强安全性和保护性的作用，显示出良好的应用前景。

2.1 灭活疫苗

ASF灭活疫苗的保护效果并不理想。传统灭活方法包括接种猪肺泡组织悬液、脾组织匀浆等不同培养方式，以及加热、甲醛、甲苯、结晶紫、复方碘、β-丙内酯、乙酰氮丙啶等物理或化学方法灭活病毒，然而均不能对强毒株攻击提供有效的保护。用免疫佐剂如PolygenTM或Emulsigen®-D对ASF灭活疫苗研究，结果表明，接种猪后虽然产生了特异性抗体，但却不具备保护作用，所有动物均表现急性经过，最后以失败告终[15]。灭活疫苗不能提供有效保护，可能是因为病毒粒子的不同成熟方式具有不同的免疫原性。病毒粒子的成熟包括细胞内成熟和细胞外成熟。细胞内成熟是指在受感染细胞的病毒工厂(viral factory,VF)中组装，形成包括病毒基因组、核心壳层、双层脂膜和衣壳结构的ASFV粒子，含有50余种蛋白；而细胞外成熟是指在VF中组装后以出芽的形式获得囊膜，并释放到细胞外，形成含CD2v、p12等病毒蛋白和部分细胞蛋白的ASFV粒子。二者表面蛋白种类数量差异巨大，可能导致了免疫失败。

2.2 减毒活疫苗

减毒活疫苗是通过分离鉴定天然致弱毒株或使用人工手段产生致弱毒株，其中又包括连续传代致弱毒株和基因工程重组致弱毒株。天然致弱毒株包括ASFV NHP68和OURT88/3，接种猪只后可抵抗同源强毒株的攻击，并提供完全保护，根据免疫程序和注射剂量的不同，保护率为66%～100%，但是对异源毒株攻击的保护率低，甚至没有保护。近年来，在爱沙尼亚出现了一种5′端基因缺失的天然弱毒株，75%的仔猪和100%的家猪感染呈急性经过后恢复正常[16]；从拉脱维亚野猪体内分离得到ASFV基因Ⅱ型弱毒株Lv17/WB/Rie1，能引起非特异、亚临床的症状，感染猪只后能完全抵抗相关强毒株的攻击[17]。

这些天然弱毒疫苗还存在高热、肺炎和慢性感染等不良反应，其安全性还有待考察。以中国ASFV HLJ/18毒株为骨架，筛选出一种具有7个基因缺失的毒株HLJ/18-7GD，使用其免疫SPF猪、商品猪和妊娠母猪后，能对强毒攻击提供完全保护，且不产生毒力返强，具有良好的保护性和安全性[18]。同时能够在猪骨髓细胞高效增殖，具有大规模产业化生产的可行性，成为当前最理想的疫苗株。人工致弱毒株可在Vero细胞、猪骨髓细胞连续传代致弱，但会出现ASFV基因组大段缺失和部分移码突变，导致免疫失败。用CRISPR/Cas9系统敲除野强毒株Georgia07的8-DR基因，成功构建ASFV重组病毒，并显著提高了重组效率，为ASFV重组致弱毒株的建立提供了新的技术和工具[19]。

2.3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是最安全的特异性抗原疫苗，先前的研究普遍集中于使用具有良好抗原性ASFV p30、p54、p72、pp62、CD2v等蛋白构建亚单位疫苗，但面对ASFV强毒株攻击的保护作用不强。用腺病毒和痘病毒载体，表达18种能被ASFV特异性淋巴细胞识别的抗原，结果未能提供有效保护[20]。有研究筛选了35种抗原制成亚单位疫苗，面对强毒攻击仍以失败告终[21]。因此，盲目地大量表达抗原基因是不可行的，需要合理筛选、组合抗原基因，并改进抗原表达系统和免疫策略。有研究提出CD2v和C型凝集素蛋白在保护性免疫上发挥了重要作用，其基因突变会导致ASFV毒力减弱，对亚单位疫苗的研发具有指导作用[22]。将亚单位疫苗和减毒活疫苗相结合，用载体表达ASFV特异性抗原作初次免疫，再以减毒活疫苗增加能够识别的抗原表位，作为加强免疫，能够提高免疫效果，为亚单位疫苗的使用提供了新思路[23]。

2.4 DNA疫苗

DNA疫苗能够显著诱导CD8+T细胞反应，不存在毒力返强的危险，展示出良好的开发潜力。将ASFV特异性蛋白和cDNA混合免疫猪只，发现能够引起较强的免疫反应，特别是使用重组蛋白pCD2-E和重组质粒pcDNA312R免疫猪后，其血清可在体外中和病毒[24]。用上述相同的ASFV特异性蛋白和不同的cDNA构建DNA疫苗，对猪只进行了3次接种，在使用ASFV Armenia 2007株的强毒攻击时，接种疫苗的猪非但不能受到有效保护，反而增强了ASFV的感染[25]。表明构建DNA疫苗时，可以选择ASFV结构蛋白基因(如p30、p54、p72等)、膜蛋白基因(如CD2v)进行免疫，也可使用DNA表达文库的思路，但前提是需要合理筛选抗原基因，才能诱导机体产生具有中和活性的特异性抗体，否则可能会导致感染的加重。

2.5 病毒活载体疫苗

除体液免疫外，细胞免疫在ASFV感染的防御中也发挥了重要作用。病毒活载体疫苗的使用可以更好地刺激细胞免疫和CTL效应。以α病毒为载体(RPs)，分别融合p30(RP-30)、p54(RP-54)、pHA72(RP-sHA-p72)基因，结果发现RP-30基因的免疫原性最强，其次是RP-54和RP-sHA-p72[26]。用47个具有潜在保护性的ASFV抗原基因制成了DNA疫苗和牛痘病毒活载体疫苗，将二者联用后，共同促进猪群的免疫反应，再以致死剂量的毒株Georgia 2007/1做攻毒试验，结果表明，虽然呈现急性经过，但能够从分子水平上显著降低病毒基因组的表达[27]。

3 展望

目前非洲猪瘟持续影响我国养猪业的发展，要阻止疫病的传播，首先要进行准确的早期诊断。虽然ELISA检测方法具有诸多优点，但如果血清的运输或保存不当，就可能产生假阳性的现象，对判定结果造成影响。而且使用血清学检测方法需要采集血液样本，由于血液中有较高水平的病毒，如果采血不当就会增加病毒传播的风险，因此应开发更多以组织液、口腔液体为目标样本的检测方法。除此之外，在ASFV感染早期不易通过血清学检测方法检出，还须结合病原分离、PCR检测等病原学检测方法进行准确诊断。

由于ASFV变异迅速、具有完备的免疫逃避机制，目前疫苗的研发仍存在困难。现有水平的灭活疫苗已均告失败。亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒活载体疫苗等基因工程疫苗的研发依赖抗原基因的合理选择，因此需要深入开展ASFV结构解析、抗原基因或蛋白的鉴定、免疫保护机制的研究工作，同时开发高效的抗原表达系统，提高疫苗株的遗传稳定性，以更好地诱导机体产生高水平抗体，因此短期内不易研发出理想疫苗。

减毒活疫苗的保护效果最为理想，是短期内疫苗的研发方向。文中提到的中国毒株HLJ/18-7GD已通过安全性和有效性评价，即将进入临床试验阶段。同时，ASFV具有自然减毒的致弱规律，会和寄生宿主家猪和野猪逐渐相互适应，现已存在感染ASFV后无症状的病例[28]，通过深入研究，可以为ASF疫苗研发提供新的思路。虽然目前在制备疫苗方面困难重重，但相信最终会研发出理想疫苗，实现ASF的有效防控。

最后，要实现ASF的净化，还要研究清楚ASF的流行病学规律。ASFV的寄生宿主包括家猪、野猪和钝蜱，目前国内主要为家猪感染，但2019年12月陕西省佛坪县报道了3起野猪感染ASFV死亡的病例，2020年3月湖北省神农架林区又报道了7起同样的病例，对ASF的净化带来了极大的困难。因此，一方面科研人员还需要深入研究ASFV进入野猪和软蜱后的维持与扩散机制，另一方面猪场工作人员在没有疫苗的条件下，必须严格做好消毒、隔离、检测和扑杀工作，依据“早、快、严、小”的原则做好科学防控，最终实现ASFV在我国的净化。