携带H1N1 pdm09基因的重配猪流感病毒分子流行特征研究进展

余良政，丁仰保，何剑桥，刘林林，崔柏杨，郭嘉宁，曾 昊，郭金凡，韦祖樟，欧阳康，黄伟坚，陈 樱

(动物传染病与分子免疫学实验室，广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004)

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza viruses，SIV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。此外，SIV还是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的原发性致病原，它能使猪群继发或者混合感染多种病原体，严重制约着我国生猪产业的发展。猪作为流感病毒的 “混合容器”，其呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒结合受体(唾液酸α-2,6-半乳糖苷，SAα-2,6-Gal)和禽流感病毒结合受体(唾液酸α-2,3-半乳糖苷，SAα-2,3-Gal)。当两种或多种流感病毒同时侵染一种宿主细胞时，伴随着病毒在宿主细胞内的不断增殖，它们的基因片段之间可以随机互换[1]，即来自不同宿主或者谱系的流感病毒可能在猪体内通过基因重配的方式产生比亲本毒株更具有感染和复制能力的新型流感病毒[2]。

人类总共经历过4次流感大流行，均与流感病毒的基因重配密切相关，基因的交替重配会驱动病毒的进化和对宿主的适应性。特别是2009年甲型H1N1大流感(2009 Pandemic H1N1，H1N1 pdm09)的暴发进一步证实了SIV可以感染人。遗传进化分析表明，H1N1 pdm09是一种新型的四重重配的猪源流感病毒，可能是由“人-禽-猪”三源流感病毒的基因片段在猪体内经过数十年的进化才得以形成，直至2009年跨种传播感染人，最终成为人类流感大流行毒株。近年来，H1N1 pdm09已与本地流行毒株频繁发生基因交换，产生了许多不同来源和重配形式的SIV变异株[3-6]。本文综述了2010年-2020年与SIV流行病学调查工作相关的研究成果，重点围绕携带H1N1 pdm09内部基因的新型重配SIV的分子流行征展开论述，为今后更好地应对新发人兽共患传染病提供参考。

1 分子流行情况

1.1 新型重配H1N1亚型SIV

2010年，我国广东最早发现了一种表面基因HA和NA来源于欧亚类禽H1N1谱系(Eurasian Avian-like H1N1，EA H1N1)，内部基因全部来源于H1N1 pdm09谱系的三源重配SIV(A/swine/Guangdong/1361/2010 H1N1，GD-1361)。动物试验表明GD-1361株不仅能在猪与猪或者猪与雪貂之间传播，也可以在人肺组织中复制。在此之后，我国其他省份也陆续报道了类似重配的H1N1亚型SIV，但不同的是，这些毒株的M基因来源于EA H1N1谱系、NS基因来源于北美三源重组H1N2谱系(North America triple reassortant H1N2，TR H1N2)，它们的重配形式较于早期发现的GD-1361株发生了显著的变化。有研究从国内10个省猪场中分离获得了228株SIV，其中EA H1N1亚型SIV的数量占比60%，这些毒株可分为两类不同的抗原群，其抗原性均有别于当时人群中主要流行的H1N1 pdm09。它们能够优先甚至完全同人型受体结合，并且部分毒株还可以在雪貂之间通过飞沫高效地传播[7]。研究发现，“纯”EA H1N1逐渐消失，而携带H1N1 pdm09内部基因的新型重配EA H1N1开始在猪群中流行起来[8]，甚至在犬群[9]中也有所发现。有学者不仅发现了广西猪群中存在着新型重配EA H1N1毒株的流行，而且血清学研究证实了EA H1N1亚型SIV一直都是该地区猪群中最主要的优势毒株之一[10]。H1N1 pdm09谱系的内部基因不仅可以与EA H1N1毒株的表面基因，而且还可以与季节性H1N1人流感病毒的表面基因发生重配。有研究从俄罗斯同一家私人农场中连续2年得到相同基因型的新型重配H1N1亚型SIV，它们的内部基因全都来自H1N1 pdm09谱系，表面基因分别与20世纪80年代的季节性H1N1人流感病毒的HA和NA基因同源性最高[11]。还有研究从广东地区分离获得3种不同基因型的H1N1亚型SIV，它们均包含有至少4个H1N1 pdm09的内部基因，其中GD101/16毒株在猪群中的血清阳性率连续两年高达32%左右[12]。最新研究表明一种新型G4 EA H1N1在我国猪场中占据了主导地位，它们具有与H1N1 pdm09毒株类似的特征，该类型毒株既能够与人型受体结合，又能够在人呼吸道上皮细胞上大量增殖，而且在雪貂中表现出高效的感染能力和气溶胶传播能力[13]。总之，携带H1N1 pdm09内部基因的新型EA H1N1亚型SIV是目前我国猪群中广为流行的毒株，它们已经危害到了人类的健康。

1.2 新型重配H1N2亚型SIV

H1N2亚型SIV分离株最早于1978年从日本猪体内获得，之后H1N2亚型SIV在东南亚地区的猪群中广泛流行。直到2004年中国才首次分离鉴定出H1N2亚型SIV，该毒株只是一种人源H3N2与猪源H1N1的二源重配病毒。H1N1 pdm09暴发后的第3年，我国学者从全国10个省份共计2 600份样品中，分离获得2株携带有6个H1N1 pdm09内部基因的新型重配H1N2亚型SIV，其HA、PB2、M、NS基因片段来自于H1N1 pdm09谱系，NA、PB1、PA、NP基因来源于类人H3N2谱系(Human-like H3N2，HL H3N2)。随后，2016年从辽宁省发现另外一种H1N2亚型SIV(A/swine/Liaoning/FX575/2016)，该毒株的HA基因来自EA H1N1谱系，NA基因来源于TR H1N2谱系，其余6个内部基因全部来自H1N1 pdm09谱系，体内试验结果表明FX575株对小鼠呈现中等致病力[14]。2018年在韩国猪群中也监测到了2株不同的新型重配H1N2亚型SIV，尽管PA基因、NP基因均来自H1N1 pdm09谱系，但是它们的表面基因HA分别来自类禽和猪流感(Classical SIV，CS)谱系，深入研究发现同时携带禽源HA基因和H1N1 pdm09毒株PA、NP基因的H1N2亚型SIV在猪和小鼠体内表现出更高的毒力[15]。

1.3 新型重配H3N2亚型SIV

2010年-2011年，我国香港、广西地区报道了携带有H1N1 pdm09基因片段的新型重配H3N2亚型SIV的出现。这些毒株的表面基因HA和NA均来源于HL H3N2谱系，内部基因全部来自于H1N1 pdm09谱系。2013年-2014年在广西猪群中同样发现了类似重配方式的H3N2亚型SIV[10]，经过连续5年的追踪，2019年，又在同一猪场分离获得与5年前基因型完全一致的新型重配H3N2亚型SIV。序列分析发现，新分离毒株的HA蛋白仍旧保持了与人受体结合的分子特征(190D、226I和228S)，却也出现了V223I或P227S的新变化[16]。2009年-2016年对美国猪群的监测发现了44种不同基因型的重配SIV，其中6种H3N2亚型SIV能够非常高效地感染猪，且不同程度地影响猪肺脏组织的损伤以及病毒的排毒情况，这些毒株至少携带有1个H1N1 pdm09基因，尤其是PA、NP、M基因来自H1N1 pdm09谱系的SIV相比于其他重配形式的毒株在猪体内表现出了较高的致病性以及较长的排毒期。

2 传播力和致病性相关的分子基础研究

2.1 传播力

H1N1 pdm09毒株内部基因NP、M和NS 3个片段的共同作用可使重组H9N2病毒获得豚鼠间高效的气溶胶传播能力，并且增强重组病毒对小鼠的毒力[17]。M基因是支持H1N1 pdm09大流行的关键因素，研究证实H1N1 pdm09病毒M基因的引入能够明显提高重组病毒在空气中的传播能力。PB1-F2是一种促凋亡蛋白，然而H1N1 pdm09的PB1-F2蛋白，由于终止密码子的存在，其编码框仅能编码11个氨基酸，PB1-F2蛋白上出现的截短突变可能是促进H1N1 pdm09在人群中快速传播的原因。PB2/627K和PB2/701N是决定禽流感病毒在哺乳动物间传播能力的关键因素，但是H1N1 pdm09病毒的PB2蛋白在627与701位仍保持禽源病毒的特征(627E和701D)，H1N1 pdm09上的“PB2/590S+591R”组合似乎弥补了PB2/627和701位点为禽类病毒氨基酸特征时病毒在哺乳动物细胞及体内的适应性。

2.2 致病力

H1N1 pdm09的病毒核糖核蛋白复合物(virus ribonucleoprotein，vRNP)在病毒哺乳动物适应性、复制能力、致病性等方面均发挥作用[18]。发生在H1N1 pdm09毒株PB1蛋白上的单个T296R氨基酸位点突变，影响了变异株体内外的复制动力学，增强了病毒在人细胞中的聚合酶活性以及对小鼠的致病力。H1N1 pdm09的PA和PB2基因均来自北美禽流感病毒，是发生过适应性变化的基因片段，其上具备感染哺乳动物的分子特征。PA蛋白上的一些氨基酸残基85I、186S和336M能够提高禽流感病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，同时也与H1N1 pdm09 毒株在哺乳动物身上的适应性和致病力有关；而PB2蛋白上的T271A的突变同样也能够提升H1N1 pdm09在人细胞中的聚合酶活性，促进病毒的增殖。H1N1 pdm09上的PB2蛋白T588I突变可以通过提升病毒复制能力以及增强病毒对β干扰素的抑制作用来提高其自身毒力。此外，H1N1 pdm09的聚合酶复合体蛋白，即PA+PB1+PB2+NP(3P+NP构造)能够为重配病毒提供较好的聚合酶活性，有助于提高重配病毒的复制能力。被携带有“3P+NP构造”的重配病毒感染的小鼠肺部细胞能够显著地高效表达病毒蛋白，高产量的病毒蛋白会引起机体过度的免疫反应，从而造成小鼠肺脏的严重损伤[19]。

2.3 兼容性

H5N1、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒，都有导致人患流感重症而死亡的情况，但是这些病毒并不具备有效且持续的“人传人”的能力。无论是人为试验条件，还是自然感染条件，H5N1、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒都能够感染猪，但是这些禽源SIV在猪群中无法建立稳定的遗传谱系。H9N2[20]、H5N1[21]等亚型禽流感病毒与pdm/09 H1N1均存在着基因适配性，自然情况下两者发生重配的概率非常高。假如在猪的体内两者关键的“功能性基因片段”能够高效地组合，产生了兼具高致病力和人际间快速传播等特点的优势流行株，这必将严重威胁到人类健康[22]。通过人为重组试验发现携带有H1N1 pdm09内部基因的H9N2亚型重配病毒相较于亲本毒株在猪的体内有着增强的复制、传播能力，并且在猪体内连续传代之后，重组病毒还能够获得“猪传猪”的能力。同样有研究证实了携带有H1N1 pdm09内部基因的禽源H5N1流感病毒也能够在猪群当中更好地复制和传播。

3 公共卫生学意义

我国学者研究发现，由于长期在猪体内得以进化，一些本土的EA H1N1亚型SIV早已获得了感染人的能力，具有了在人群中有效传播的潜能，而且人群中普遍缺乏针对这类病毒的中和抗体，因此它们被视作是最有可能引起下一轮人类流感大流行的病毒[7]。EA H1N1亚型SIV同H1N1 pdm09存在基因兼容性，它们能够在猪体内发生重组，产生的子代病毒在小鼠和豚鼠模型上均有增强的毒力以及传播能力。国内已经报道了5例EA H1N1亚型SIV感染人的事件。其中，2015年首次报道了1株三重重配EA H1N1毒株感染人的事件。2016年和2019年，福建[23]、天津地区[24]也相继出现了新型重配EA H1N1亚型SIV(A/Fujian-cangshan/SWL624/2016、A/Tianjin-baodi/1606/2018)感染人的情况，SWL624和TJ1606这类基因型的毒株(G4 EA H1N1)具有高度适应和感染人类的特征[13]。H1N1 pdm09的内部基因很可能逐渐替代了早期感染人的“纯”EA H1N1亚型SIV的内部基因，并且新型重组SIV仍然保留了感染人的能力。自H1N1 pdm09暴发后，美国发现了一种携带了H1N1 pdm09毒株M基因的猪源H3N2亚型变异病毒(H3N2 variant，H3N2v)，监测数据显示，H3N2v不仅能够感染人，而且还存在有限的“人传人”的迹象。研究进一步证实了H1N1 pdm09的M基因在多种动物模型中均可以增强重配毒株的传播能力。此后，H3N2v长期存在于美国的人群当中，每年都会引发零星感染，而且病毒本身也在不断地发生变异[25]。在澳大利亚同样存在猪源H3N2v(A/South Australia/85/2018，SA85)感染人的情况，但是SA85株的内部基因全部来源于H1N1 pdm09谱系，表面基因HA和NA均来自10年至25年前澳大利亚本地流行的人流感病毒[26]。2019年，中国广东也发生了的猪源H3N2v(A/Guangdong/YueFang 277/2017，GD-YF)感染人的事件，该病毒的内部基因同SWL624株、TJ1606株保持一致，区别在于GD-YF株的表面基因HA和NA均来源于较早期的HL H3N2谱系[27]。综上所述，H1N1 pdm09的内部基因具有广泛的基因兼容性，能够接受不同亚型或来源流感病毒的HA和NA基因的替换。当抗原性发生改变，必然会导致动物机体中的抗体不能有效阻断病毒的入侵，从而引起免疫失败或保护效力低下。此外，H1N1 pdm09的内部基因还可能增强重组病毒的传播能力，一旦新型重配SIV能够适应新宿主，进行自我复制，极有可能会导致新一轮的人类大流感大暴发。

4 展望

H1N1 pdm09的暴发证实了通过中间宿主“猪”产生的新型重配SIV能够跨越种间屏障感染人，并且可能进一步引发人类流感大流行。自从2009年H1N1 pdm09暴发以来，该病毒在其10年的进化过程中逐渐成为了一种季节性的流感病毒，在人群中持续传播。更重要的是，它们还不断地潜伏到猪群当中，与本地SIV流行株频繁发生重组，产生不同传播能力、致病性等的新型优势毒株。当前，世界各地的猪群中广泛分布着携带有1～6个H1N1 pdm09内部基因的新型重配SIV，它们的重组形式复杂多样，在流感病毒的生态循环中起到了关键推动的作用。H1N1 pdm09在人际间高效、迅速地传播能力与其独特的内部基因构造有着密切的联系，鉴于其广泛的基因兼容性，一些禽源流感病毒的NS和M基因片段也都能够与H1N1 pdm09的内部基因发生重配。如果在特定的重配模式下，参与重配的关键性基因片段之间能够发挥协同作用，那么重组后病毒不仅能很好地适应新的哺乳动物，而且还具有显著的致病性、感染力、复制力和传播力。无论是2015年-2018年发生在中国的“EA H1N1亚型SIV感染人致死”的事件，还是2011年-2016年期间发生在美国的“猪源H3N2v在人群中小规模暴发，造成有限人传人”的事件均说明了携带H1N1 pdm09内部基因的新型重配SIV具有感染人的特性，并且已经开始对人类健康造成了一定程度的危害。因此，持续加强对SIV 的监测将有助于防控流感病毒的人类大暴发。