猪δ冠状病毒致病机制研究进展

江 珊，李秀丽，张 莉，王利丽，李富强，路 超，郑 丽，鄢明华*

(1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.农业农村部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站，天津 300381)

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种猪肠道致病性冠状病毒，该病毒可感染不同年龄段的猪群，仔猪感染PDCoV后主要出现腹泻、呕吐、脱水和死亡等临床症状[1]。该病毒自2012年发现于中国香港，现已在美国、加拿大、韩国、中国、泰国、老挝、越南等多个国家广泛流行，在世界范围内对养猪业造成了严重经济损失[2-3]。PDCoV是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科δ冠状病毒属的成员，是一种有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，基因组全长约25.4 kb，可编码4种结构蛋白、3种辅助蛋白和15种非结构蛋白[4-5]。

PDCoV通过粪便-口腔途径传播，并在小肠绒毛上皮细胞的细胞质中复制[6-7]。受感染的小肠绒毛上皮剥脱，随后出现绒毛萎缩[6-7]。小肠细胞的大量丢失阻碍了小肠内营养物和电解质的吸收和消化，从而导致仔猪出现吸收不良和消化不良性腹泻以及由此引发的致命脱水[7]。目前，PDCoV的致病机制尚不清楚，尚无有效防治该病毒的疫苗和药物。本文从PDCoV入侵细胞、逃逸宿主细胞天然免疫应答、诱导宿主细胞凋亡，以及影响该病毒复制的其他分子机制等方面，就PDCoV致病相关的主要分子机制进行综述，以期为今后深入认识PDCoV致病机制及研制有效防治该病毒的疫苗和药物提供参考。

1 PDCoV入侵细胞的分子机制

PDCoV能够通过两种蛋白酶入侵宿主细胞，一种是细胞表面的胰蛋白酶，另一种是内吞体中的组织蛋白酶L(cathepsin L,CTSL)和组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)[2]。使用内吞体酸化抑制剂巴非霉素-A1(bafilomycin-A1，Baf-A1)处理细胞可完全抑制PDCoV的入侵，而抑制CTSL或CTSB的表达则可显著减少PDCoV的感染，这表明PDCoV能够通过内吞的方式入侵细胞。用胰蛋白酶处理细胞，能够诱导S蛋白的裂解与活化，从而使PDCoV从细胞表面直接入侵宿主细胞。另有研究发现，细胞膜和病毒囊膜中存在的胆固醇对PDCoV病毒的入胞有关键作用，有助于PDCoV的复制[8]。用甲基-β-环糊精降低来源于细胞或病毒的胆固醇含量，可减少PDCoV对细胞的感染。而对已经甲基-β-环糊精处理的细胞或病毒，添加外源性胆固醇可适度恢复PDCoV的感染性。

近年来，不同研究团队对猪氨基肽酶N(porcine aminoptidase N，pAPN)是否为PDCoV入侵宿主细胞的功能性受体进行了研究，但结果并不全部一致。研究发现，过表达pAPN不能使PDCoV在其非易感细胞幼仓鼠肾细胞BHK-21上增殖，pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体[9]。PDCoV的S1蛋白与pAPN之间存在相互作用，并证明pAPN能够介导PDCoV与宿主细胞表面结合，感染宿主细胞[10-11]。过表达pAPN可以使PDCoV感染非易感的BHK-21细胞，然而，特异性抑制pAPN表达并不能完全阻断PDCoV感染猪回肠上皮细胞IPI-2I[12]。该研究表明pAPN虽然是PDCoV入侵细胞的功能性受体，但可能不是关键的功能性受体。PDCoVS1蛋白与pAPN存在相互作用，敲除pAPN可显著降低PDCoV对细胞的感染，在过表达pAPN后可挽救这一抑制作用，再次证明了pAPN是PDCoV入侵细胞的功能性受体[13]。

2 PDCoV逃逸宿主细胞天然免疫应答

天然免疫应答是宿主细胞抵御外源微生物(如病毒、寄生虫和细菌)的第一道防线。病毒感染细胞后，其病原相关分子模式首先被来自细胞的模式识别受体识别，后者通过调节下游多种级联信号，诱导天然免疫应答的关键产物Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)的产生。Ⅰ型IFN进而与细胞膜上的干扰素受体结合，激活裂解酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活子(Jak-STAT)通路，促进下游干扰素刺激基因的表达，从而发挥天然免疫作用，抑制病毒的增殖。为了成功在细胞中增殖，病毒进化出多种策略拮抗Ⅰ型IFN的产生，从而逃逸宿主细胞天然免疫应答。

PDCoV感染猪肾小管上皮细胞LLC-PK1后，能够通过靶向干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)阻断维甲酸诱导基因Ⅰ信号通路，干扰仙台病毒或双链RNA的合成类似物聚肌苷酸介导的 IFN-β启动子的激活，显著抑制IFN-β的产生[14]。PDCoV能通过阻断IRF3和p65的磷酸化与核转位来抑制仙台病毒诱导的IRF3和NF-κB的启动子活性，从而抑制了对IFN-β启动子的激活作用[14],该研究首次提出了PDCoV的天然免疫逃逸策略。PDCoV基因组编码的非结构蛋白、辅助蛋白及结构蛋白均在其天然免疫逃逸过程中发挥重要作用。PDCoV非结构蛋白5(nonstructure protein 5，NSP5)是Ⅰ型IFN的颉颃剂，可削弱NF-κB必须因子蛋白的表达，阻碍Ⅰ型IFN的生成[15]。在Ⅰ型IFN下游，NSP5也能通过裂解Jak-STAT信号通路中关键蛋白STAT2，抑制干扰素刺激基因的表达，从而抑制天然免疫应答[16]。NSP5还可通过其蛋白酶活性，直接裂解Ⅰ型IFN下游的干扰素刺激基因猪mRNA-脱帽酶1A(porcine mRNA-decapping enzyme 1a，pDCP1A)，以减弱pDCP1A的抗病毒活性[17]。作为PDCoV辅助蛋白的NS6可以与RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation gene 5，MDA5)发生互作，这种互作能够干扰RIG-Ⅰ/MDA5与双链RNA的结合，抑制IFN-β的产生[18]。PDCoV的结构蛋白N蛋白可以通过干预双链RNA及蛋白激酶R活化蛋白(protein kinase R (PKR)-activating protein，PACT)与RIG-Ⅰ的结合，以及抑制RIG-Ⅰ的K63多聚泛素化，颉颃IFN-β的产生[19-20]。

3 PDCoV诱导宿主细胞凋亡

细胞凋亡是细胞发生的受自身基因调控的自杀行为，病毒感染等多种应激条件下均可发生，对抵抗病毒感染起着至关重要的作用。病毒感染宿主细胞是一种相互作用的过程，细胞可以通过凋亡过程清除病毒，抵抗病毒感染；病毒能够延长细胞的存活时间，以最大限度地提高子代病毒的产量，或者通过促进细胞凋亡，增强子代病毒的释放和传播，从而进一步侵袭邻近的细胞。

PDCoV在体内不能诱导肠上皮细胞凋亡，但可诱导受PDCoV感染的猪肾细胞LLC-PK细胞和猪睾丸细胞ST细胞凋亡[21]。在感染PDCoV的仔猪肠绒毛上皮细胞中出现的空泡变性和坏死不是细胞凋亡引起的，可能是由于病毒的细胞溶解作用而导致的细胞坏死。PDCoV可通过激活细胞色素C介导的线粒体内源性途径，诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依赖性细胞凋亡[22]。PDCoV感染ST细胞后，通过募集Bax基因或线粒体通透性转换孔的开放刺激线粒体外膜通透性，使凋亡线粒体细胞色素C释放到细胞质中，从而激活Caspase依赖的内源性凋亡途径，促进病毒体外复制。另有研究表明，在PDCoV感染的ST细胞中，caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性随病毒感染量的增多而显著提高，表明PDCoV感染可同时激活内源性与外源性ST细胞凋亡通路[23]。氯化锂和甘草酸二铵可以抑制PDCoV感染引起的LLC-PK1细胞凋亡，但二种药物是否通过抑制细胞色素C介导的线粒体内源性途径抑制PDCoV诱导的细胞凋亡有待进一步研究[24]。

PDCoV并非可诱导所有宿主细胞发生凋亡。使用PDCoV感染猪空肠上皮细胞IPEC-J2，经免疫荧光和TUNEL染色发现，多数PDCoV抗原阳性的IPEC-J2细胞未出现TUNEL阳性信号，表明PDCoV体外感染IPEC-J2细胞可能不诱导细胞发生凋亡，而是导致细胞坏死[25]。

4 影响PDCoV复制的其他分子机制

病毒的基因组大小及编码能力有限，为了实现大量增殖，会借助大量细胞因子或细胞内信号通路来完成自身复制。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路是控制大量细胞过程的中枢信号网络。细胞外信号调节激酶是MAPK信号通路的一种，由Raf、MEK1/2和ERK1/2这3个连续作用的激酶组成。在细胞外刺激下，这一信号通路导致许多ERK1/2下游底物磷酸化，使细胞增殖、分化或凋亡。多种病毒利用这一信号通路，在宿主细胞内高效复制。PDCoV在感染细胞早期诱导ERK1/2的激活，ERK1/2的激活是PDCoV在宿主细胞中产生子代病毒的必要条件[26]。抑制PDCoV诱导的ERK的激活，会影响PDCoV吸附细胞后病毒的生物合成与释放。

钙离子(Ca2+)是一种多功能的细胞内信号分子，广泛调节细胞内的信号传递。钙离子参与调节心脏收缩、受精、胚胎成熟、细胞能量代谢、增殖和凋亡等多种过程，在细胞生理和病理过程中发挥着重要作用。钙离子在细胞内外环境中维持着一定的浓度梯度，这种浓度梯度会受到通道、运输器和泵的调节，以适应细胞的需要。PDCoV感染IPI-2I细胞后，可上调细胞内钙离子浓度[27]。EGTA螯合细胞外钙离子能够抑制PDCoV的复制，且这种抑制作用可通过补充钙离子来弥补。L型钙离子通道阻滞剂盐酸地尔硫卓能够通过抑制PDCoV复制周期中复制步骤，显著减少PDCoV的感染。此外，L型钙离子电压门控通道亚单位CACNA1S的敲除也可抑制PDCoV的复制,表明PDCoV能够通过调控钙离子内流促进自身复制。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种能够有效沉默或抑制目标基因表达的技术，这种沉默或抑制作用是通过双链RNA选择性地抑制目标基因mRNA的活性来实现的。RNAi可以通过短发卡RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)或小干扰RNA干扰病毒复制，且与siRNA相比，shRNA的抑制作用更稳定、更持久、更有效。有研究构建了以PDCoVM和N基因为靶点的2个短发卡RNA表达质粒pGenesil-M和pGenesil-N，将2种质粒分别转染ST细胞后感染PDCoV病毒，从细胞病变、病毒滴度和PDCoV RNA水平等角度对两种质粒对PDCoV复制的抑制作用进行了评价[1]。与对照组相比，转染pGenesil-M或pGenesil-N的ST细胞中，PDCoV所致的细胞病变程度较轻，PDCoV的滴度和PDCoVRNA水平显著降低。该研究首次报道了以PDCoV的M和N基因为靶点的shRNAs在体外发挥抗PDCoV作用，表明RNAi可以有效抗PDCoV感染。

氯化锂和甘草酸二铵是2种广谱抗病毒药物，研究发现两者对LLC-PK1细胞PDCoV的复制均具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依赖性[24]。甘草酸二铵可以抑制PDCoV在细胞表面的附着，但具体作用机制有待进一步研究。从抗病毒效果来看，氯化锂的抗病毒活性优于甘草酸二铵，且甘草酸二铵的毒性小于氯化锂。两种药物联合应用时，对LLC-PK1细胞中PDCoV复制的抑制不具有协同作用。虽然研究表明氯化锂和甘草酸二铵有潜力成为抗PDCoV的药物，但目前两种药物在体外对PDCoV复制抑制作用的分子机制及体内是否对PDCoV有抑制作用尚不清楚。

5 展望

PDCoV是猪重要的病毒性病原，现已成为引发我国猪腹泻性疾病的主要病原之一。病毒的致病机制是研发有效疫苗和防治药物的重要依据，因此，开展对于PDCoV引发疾病的防控相关研究具有重要意义。与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒病毒等病原相比，关于PDCoV致病机制的研究相对较少，PDCoV入侵细胞的途径、通过诱导细胞凋亡以及逃逸天然免疫应答促进自身复制等更多的PDCoV致病相关分子机制有待进一步探索。此外，尽管一些PDCoV编码蛋白在其复制中的作用已经明确，但对编码蛋白的结构尚不清楚，其功能也需进一步研究。目前对PDCoV编码蛋白功能的研究集中于PDCoV逃逸宿主细胞天然免疫应答分子机制，但这些编码蛋白是否通过其他分子机制参与PDCoV在宿主细胞中的复制，目前尚不清楚。MicroRNA(miRNA)是一类参与基因表达转录后调控的非编码RNA，在许多生物学过程中发挥着重要的调控作用。研究者已对影响其他引起猪腹泻的冠状病毒(如猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒)复制的miRNA及分子机制进行探索，未来，miRNA也有望成为抗PDCoV感染新的研究热点。

新型冠状病毒肺炎简称新冠肺炎，WHO于2020年2月11日正式命名为 2019 冠状病毒病仍在全球的广泛流行，使冠状病毒再次成为人们关注的焦点。然而，人们对冠状病毒致病机制的了解还远远不够。未来，对不同冠状病毒之间致病机制的共性与特性比较研究，也将对冠状病毒的抗病毒药物或疫苗的研制具有重要而深远的意义。