猪轮状病毒检测技术研究进展

杨志刚，汤德元，张 森，韩超逸，晏仁潭

(贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025)

猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要原因之一。英国于1974年首次报道了该病，随后在北美洲、南美洲、非洲和澳大利亚都有报道该病。我国于1981年首次分离到该病毒，目前PoRV在东北、华北、华南、西北等地都有报道[1-3]。该病毒通过粪-口途径传播，感染肠道肠上皮细胞，临床症状为腹泻、呕吐、厌食、脱水。猪轮状病毒是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，是一种双链RNA病毒，基因组包含11段双链RNA，编码6个结构病毒蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5/6)。轮状病毒基于其VP6蛋白抗原性不同分为10个基因群(A-J)，其中RVA、RVB和RVC与仔猪腹泻有关，几十年前就发现猪的RVE，但不常见，近年来在日本、巴西和美国发现了猪的RVH[4]。尚无针对该病毒的有效治疗药物，虽然开发出了相应的疫苗，但由于PoRV区域流行不同和遗传多样性，导致该病毒不能完全被控制。轮状病毒基因群、基因型多样及该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病即时准确诊断方法的建立就显得尤为重要。本文总结了PoRV的检测技术，旨在为PoRV的现场诊断和预防该病提供技术支持。

1 传统方法

1.1 病毒的分离培养

PoRV的分离培养可以采用MA104细胞系、Marc-145细胞系和Vero细胞系等。时洪艳等[5]从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离1株病毒，将该分离株在MA104细胞上进行盲传，连续传至25代，并进行3次蚀斑纯化，通过电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析，分离出1株PoRV。杨文宇等[6]从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV，并通过PCR检测、病毒理化试验与微量中和试验证实，命名为SC-R株，同时将SC-R株接种Marc-145细胞，盲传至第4代出现CPE，第6代出现典型的PoRV病变特征，研究表明胰酶可增加PoRV对细胞的感染性，最为适用的胰酶浓度是30 g/L。杨娟等[7]将1份经RT-PCR检测PoRV阳性腹泻粪样品经胰酶处理后接种Vero细胞，盲传至第8代出现了明显的病变，提取该细胞培养物进行RT-PCR检测显示扩增条带与目的条带相符，测序结果与其他PoRV毒株相近，成功分离出PoRV。然而，不管采用哪种细胞分离培养该病毒，都有分离周期长、费用高、基层应用少等缺点。

1.2 电镜观察诊断法

电镜观察诊断技术包括直接电镜法和免疫电镜检测法。直接电镜法是最早用于检查粪便中RV的方法，该法操作简便，观察到轮状病毒大小和形状的病毒即可判定为阳性；免疫电镜法主要利用特异性抗体俘获病毒，可通过观察聚集的病毒抗原复合物来判断结果，也可以使用多价抗体，实现同时检测其他与腹泻有关的病毒的要求。Mebus等于1969年通过电镜观察诊断成功分离出世界上首例牛轮状病毒。Benfield D A等[8]比较了商业酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、电镜观察(electron microscopy,EM)、荧光抗体(fluorescent antibody,FA)和病毒分离(virus isolation,VI)检测牛和猪RV的灵敏度，对73份牛和116份猪种样品进行了评估。结果显示，对于牛的样品，商业ELISA与EM一样灵敏且比FA和VI灵敏，对于猪的样品，EM比FA、ELISA和VI更为敏感。但由于电镜法需要更高的设备和较高的成本投入，它不适合大规模样品检测及广泛推广。

2 免疫学检测技术

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据抗原与抗体结合原理来对PoRV进行检测，试验操作简便、灵敏度高、特异性强、准确性高，但每次试验必须有阳性对照。Memon A M等[9]基于RVA VP6定向的兔多克隆抗体，开发了一种检测PoRVA抗原捕获酶联免疫吸附试验(AC-ELISA)，对中国不同省份收集的295份猪粪便/腹泻样品进行了评估，并与常规RT-PCR和RT-qPCR进行了比较，敏感性和特异性分别为91.67%和100%，且不与PEDV、TGEV、PRV和PCV2发生血清交叉反应。

2.2 免疫层析试纸条检测技术

免疫层析试纸条检测技术是基于免疫标记技术和色谱层析技术发展起来的一种可用于检测抗原、抗体或半抗原的检测技术。Kang J H等[10]建立了一种快速简便的免疫层析试纸条检测方法，用于粪便标本中PoRV的特异性检测，在小鼠中产生了针对PoRV OSU株的单克隆抗体，其中，选择了2个对VP6有特异性的单克隆抗体-1和单克隆抗体-2，将单克隆抗体-1用于包被微粒，而将单克隆抗体-2固定在硝酸纤维素膜条上以形成检测线，通过固定抗小鼠IgG抗体，在经过检测线的同一膜带上形成对质控线，该方法能够在不到5 min检测1 000个PoRV/mL的斑块形成单位，并且特异性良好，对14份样品进行检测，有9份阳性，5份阴性，与RT-PCR结果一致，该方法快速简单，易于实施，准确廉价。

3 分子生物学技术

3.1 RT-PCR

现已有多种检测 PoRV的PCR方法报道。根据轮状病毒VP6蛋白特异性抗原决定簇(SGⅠ、SGⅡ、SG(Ⅰ+Ⅱ)和无SG(Ⅰ+Ⅱ))将轮状病毒分为至少4个亚组，然而，针对人和猪轮状病毒VP6蛋白表位的单克隆抗体有时不能识别SG特异性表位或识别无关的SG表位，因此导致亚组的错误分配，为区分这4种亚组，Thongprachum A等[11]基于VP6基因组设计了2对引物开发了一种多重RT-PCR，通过新的多重RT-PCR方法确定的人和猪轮状病毒的基因组与通过单一RT-PCR和VP6序列分析确定的基因组具有100%的一致性，该方法特异性高、灵敏度好、耗时少，且成功地对儿童和仔猪急性腹泻中传播的轮状病毒临床分离株进行了基因分组。张双翔等[12]针对 PoRV VP6和VP7基因设计了2对 RT-PCR特异性引物，并分别建立了检测PoRV VP6基因和VP7基因的RT-PCR快速方法，使用这2种检测方法对临床102份样品进行检测，二者阳性检出率无差异性(P>0.05)。

在实际应用中，很多疫病都能导致猪的腹泻，因此能够快速地区分临床症状及病理变化相似的病例的多重PCR方法得到了快速的发展。Zhao J等[13]建立了一种能同时检测PEDV、TGEV、PoRVA和PCV2的多重RT-PCR检测方法，该4种病毒的敏感性分别为2.17×103、2.1×103、1.74×104、26×104copies/μL。Liu G等[14]建立了同时检测PEDV、TGEV、RVA、RVC和PCV2的多重PCR，该试验能够区分该5种病毒，而不会与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒1型(PPV1)、CSFV、猪博卡病毒(PBoV)和猪星状病毒(PAstV)发生交叉反应，该方法每次反应每种病毒最低限度为50 copies/μL。蒲翠敏等[15]建立了建立一种同时检测PEDV、TGEV和PoRV的三重PCR检测方法，该方法能够扩增出PEDV、TGEV和PoRV特异性片段，且不能检出PCV2、CSFV、PRRSV，对PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×102、1×100、1×103copies/μL。苗艳等[16]建立了一种可同时检测PEDV、TGEV、PoRV和猪嵴病毒(PKV)多重RT-PCR检测方法，PEDV、TGEV、PoRV和PKV的最低检出量分别为1.33×104、1.33×103、1.33×104、1.33×105copies/μL。Ding G等[17]建立了能同时检测PKV、TGEV、PEDV、猪δ冠状病毒(PDCoV)、PoRVA和札幌病毒(PSaV)的多重RT-PCR方法，该方法每次反应每种病毒最低限度为100ng～101ng cDNA，并且未与PRRSV、CSFV、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)和口蹄疫病毒O型(FMDV-O)的cDNA和PRV的DNA发生交叉反应。曲雅新等[18]建立一种同时检测PRoV、猪札幌病毒(PoSaV)和猪星状病毒(PAstV)的三重PCR方法，该方法对TGEV、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等常见猪病病毒的检测结果均为阴性,PRoV、PoSaV和PAstV的检测限量分别为1.38×102、8.33×102、4.40×103copies/μL。

3.2 实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR，RT-qPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过荧光信号积累来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对待测样品模板进行定量分析的方法，该技术不仅能定性还能定量。目前已经开发出许多用于检测PoRV的实时荧光定量RT-PCR方法。高婉俊等[19]建立了检测猪RVA的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，建立的方法在1.0×102copies/μL～1.0×109copies/μL范围内线性关系良好，反应扩增效率大于90，扩增相关系数大于0.98，对CSFV、PRRSV、TGEV和PCV2均检测不到荧光信号，表明该方法特异性强，该方法批内和批间变异系数均小于2%，重复性好。陈如敬等[20]建立了检测PoRV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，该方法最低检测量为192 copies/μL，对猪常见病原(如TGEV、PEDV、CSFV等)检测均为阴性，使用该方法和常规RT-PCR对79份猪腹泻病料进行检测，符合率达100%。

检测PoRV的多重实时荧光定量RT-PCR方法已有多个报道。Marthaler D等[21]建立了能同时检测RVA、RVB和RVC的多重RT-qPCR方法，并对7 508份猪腹泻样本进行了检测，检出率分别为62%、33%、53%，该方法能更好地对猪的RVA、RVB和RVC进行监测和流行病学研究，从而最终获得更好的预防和控制策略。李军等[22]建立了同时检测TGEV、PEDV和PoRVA的多重荧光定量RT-PCR检测方法，该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRoVA，而与其他病原无交叉反应；对TGEV、PEDV和PoRVA的最低检测量分别为1.12、39、25 copies/μL；组内和组间变异系数均小于5%；该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100 %。Wen D等[23]建立了能同时检测TGEV、RVA、RVC、PEDV和PCV2的多重RT-qPCR方法，该方法对检测和区分TGEV、RVA、RVC、PEDV和PCV2具有很高的灵敏度，检测限为5 copies/μL～50 copies/μL，重现性好，Tm和循环阈值的变异系数分别小于0.32%和2.86%，通过单次和多次RT-qPCR对90个现场样品进行测试，符合率为91.1%，该EvaGreen RT-qPCR方法快速、灵敏、低成本。施开创等[24]建立了同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，该方法特异性较强，对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×102、2.06×102、2.06×101、2.06×103copies/μL，具有较高敏感性，组内与组间变异系数均小于1.1%，具有良好的重复性。Jia S等[25]基于DPO引物建立了能同时检测PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV多重实时SYBR Green RT-PCR检测方法，该方法与传统的引物相比，DPO引物允许更宽的退火温度范围(40℃～65℃)，对PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV的检出限分别为8.63×102、1.92×102、1.74×102、1.76×102copies/μL。许梦怡等[26]建立了同时检测TGEV、PEDV、PoRV的三重荧光定量PCR方法，该方法对TGEV、PEDV、PoRV的检测灵敏度分别为2.49、4.36、4.96 copies/μL。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术一种新型的恒温核酸扩增技术，该方法特异性强、灵敏度高、快速简便。Hu X等[27]建立了可以用于检测PoRV的RT-LAMP测定方法，依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列设计了6条特异性引物，并优化了反应条件，该方法灵敏度达到了102copies/μL，只有PoRV获得特异性扩增条带，与其他TGEV、PEDV、CSFV等无交叉反应，具有良好的特异性，发生反应后用肉眼检查发现阳性扩增产物出现白色沉淀，加入SYBR Green Ⅰ发生颜色变化可判定结果，该方法可以快速、特异、灵敏的检测PoRV。

3.4 原位杂交技术

原位杂交技术(ISH)是一种用于检测福尔马林固定、石蜡包埋组织切片内特定核酸序列的方法。与PCR相似，ISH基于DNA和RNA序列，但具有识别组织学病变内核酸的能力。传统的ISH技术具有良好的特异性，但由于短核苷酸序列的标记效率较低，因此敏感性有限。Resende P等[28]建立了一种基于RNA的原位杂交显色技术，以检测RVA、RVB、RVC，该方法与其他病毒不存在交叉反应，探针具有良好的特异性，但灵敏度不高，最多只能检103copies/mL RV RNA。

3.5 纳米孔测序技术

纳米孔测序仪由牛津纳米孔技术公司于2014年发布，该设备简单便携，可通过一台笔记本电脑在现场完成目标检测，它有低成本、单分子测序、测序数据实时监控和超长读长等特点[29]。Theuns T等[30]首次应用纳米孔测序作为猪病毒性肠炎的诊断工具，研究了纳米孔测序用于病毒检测的能力，首先，将细胞培养的猪流行性腹泻病毒和RVA混合，并在MinION上测序，测序开始后7 s已检测到读数，3 h后测序深度较高(19.2 X～103.5 X)，接下来，分析了1周龄仔猪的腹泻粪便，几乎所有读物(99%)都属于噬菌体，这可能重塑了仔猪的微生物组，更重要的是一种猪嵴病毒被发现。通过纳米孔测序样品中所有病毒和其他病原体可以在一次读数中给出，而无需进行其他诊断测定。目前，定价可能是妨碍兽医学样品高通量分析的一个方面，但是随着技术的快速发展，该技术将在不久的将来在兽医学领域得到更广泛的应用。

4 小结与展望

综上所述，检测技术均有各自的优缺点：①病毒的分离培养具有分离周期长、花费高、基层应用少等不足，但可以分离出病毒，从而进行进一步研究；②电镜观察诊断法需要较高的设备和专业人员投入，不适合大规模样品检测以及广泛的进行推广；③免疫学检测技术可能出现假阳性并且检测成本较高，其中免疫层析试纸条检测技术虽然灵敏度有待提高，但快速简单、易于实施和准确廉价，适合基层应用；④分子生物学技术缺点是费用高，但具有较高的灵敏度和特异性，且可以区分其不同基因型。因此，在实际应用时应根据不同的情况选择不同的检测方法。

很多实验室对于PoRV的检测技术做了很多探索，开发了一些在PoRV鉴定方面有很好应用前景的方法，但还是存在使用限制、检测成本和检测结果的灵敏度等问题。目前，我国PoRV流行率不断增加，遗传多样性越来越高，且我国有关PoRV流行病学方面的研究数据相对较少，因此，PoRV的检测方法应该进行不断更新，以期对PoRV进行更精确的流行病学监测和防控。