长链非编码RNA对免疫功能的调控作用研究进展

郭东光，陈明艳，王 丰，卞爽丽,2，崔芳微,2，李文明,2，郭赞莹，孙国鹏，李 鹏，朱艳平，岳 锋，王选年*

(1.新乡学院生命科学与基础医学学院/动物疫病分子诊断河南省工程实验室，河南新乡 453000；2. 郑州大学生命科学技术学院，河南郑州 450000)

近年来，越来越多的证据表明，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是参与免疫反应的重要调节分子，在机体免疫应答过程中可能扮演着重要角色[1]。其可以通过碱基互补配对或折叠成特殊三维空间结构等方式，与DNA、RNA和蛋白质等其他生物大分子相互作用，发挥着多种生物学功能，共同构成了一个复杂而精细的分子调控网络[2]。通过综述免疫系统中lncRNA功能和调节机制相关方面的研究内容，如对造血干细胞的发育、细胞特异性免疫通路、免疫细胞的激活和分化、调节炎性细胞因子的分泌和参与调节免疫细胞的效应功能等，为进一步深入了解免疫系统中lncRNA的特异性生物学调节功能提供参考。

1 长链非编码RNA的概念及分类

随着转录组测序技术的飞速发展，约超过70%的基因组被认为是可以转录，且大部为lncRNA。lncRNA是一种 RNA聚合酶Ⅱ转录生成的类似 mRNA 的新型转录物，是近年来新发现的长度大于200 nt的非编码单链RNA分子[3]。据研究显示，在人类基因组中存在约5.8万个lncRNAs，但很多尚未经过功能验证，被认为只是作为转录“噪音”存在[4]。lncRNA 虽不参与蛋白质的表达， 但在转录及转录后水平参与了基因表达的调控，以RNA 形式在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期等多种生物学过程以及基因组印记、染色质修饰、转录干扰、蛋白质活化等多种细胞活动过程中发挥重要调节作用[5]。lncRNA 分类繁多复杂，根据lncRNA 与蛋白质编码基因的位置关系可分为正向 lncRNA、反向 lncRNA、双向 lncRNA、基因内lncRNA和基因间 lncRNA。以 lncRNA 在 DNA 序列中的作用分为以调节邻近基因表达为主的顺式 lncRNA和调节远处或其他基因表达的反式 lncRNA。根据lncRNA 的作用机制分为诱饵分子、信号分子、引导分子和支架分子。与mRNA一样，多数lncRNA都有帽子结构、剪接体和多聚腺苷酸尾巴[6]。

2 长链非编码RNA对造血干细胞分化调节

造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的不断自我更新及其分化为功能性的终末免疫细胞类型与机体持续性免疫能力的产生密切相关，这一过程受到细胞内特异性基因协同表达的严格控制[7]。有证据表明lncRNA可能是这一过程中充当细胞外源信号和细胞核转录因子活性之间的重要调节分子。研究表明，lncRNA H19对维持长期造血干细胞(long-term HSCs)沉默发挥了关键调节作用。在胚胎发生过程中其通过将甲基-CpG-结合蛋白MBD1和组蛋白赖氨酸甲基转移酶复合物招募到“印记”靶基因位点来调节母体印记，同时将H3K9-甲基化的抑制性标记连接到靶基因上使之传递给子代细胞，以保持其基因的表达状态[8]。而当long-term HSCs分化为短期造血干细胞(short-term HSCs)时，H19的表达显著下调。同样，母体H19的缺失也会导致long-term HSCs的丧失和短期short-term HSCs的增加。此外，long-term HSCs H19的缺失还会导致HSCs失去自我更新能力并使其分化为下游的细胞类型。研究结果表明，在一定程度上这种表型的改变至少可以通过解除H19抑制性靶基因IGF2(编码生长因子IGF2)来实现，因为其增加了依赖性转录因子Foxo3进入细胞周期的机会[8]。

为确定是否有其他lncRNA参与调控早期造血干细胞的分化过程，利用二代测序技术分析造血祖细胞和终期细胞类型中的非编码RNA的结果显示，在所检测细胞中共发现了2 500多个表达的lncRNAs，其中在HSCs细胞中共富集159个lncRNAs。通过体内外试验表明，lncHSC-1的缺失导致骨髓细胞的分化改变；lncHSC-2的缺失会导致HSC自我更新能力受损和T细胞分化能力增加[9]。

此外，经CHIRP(chromatin isolation by RNA purification)分离后的测序结果表明，在染色体基因组启动子区和5′非翻译区上共发现264个基因组结合位点，其中，lncHSC-2显著富集的结合位点是 DNA结合基序中的E2A转录因子，其在HSC和淋巴细胞发育中具有重要调节作用。这表明lncHSC-2可能通过募集E2A以发挥对靶基因的靶向调节的功能。进一步研究显示，lncHSC-2表达缺失抑制了E2A对编码溶神经素Nln、编码溶质载体Slc35c2和编码整合素β2的Itgb2的募集[9-10]。这些研究共同确立了lncRNA在HSC分化调控中的作用，并表明lncRNA介导的基因调控与伴侣转录因子的活性相一致，可能是造血过程中常用的调控策略。

3 lncRNAs在髓系分化中的调节作用

巨噬细胞(macrophages)和树突状细胞(dendritic cells,DCs)均来自骨髓中普通髓系祖细胞(bone marrow,BM)，其依赖细胞信号和细胞因子刺激及其关键转录因子的表达进行发育和分化[11]。对lncRNAs Morrbid和lnc-DC在调节髓系细胞生存和分化中的研究作用表明，Morrbid的表达与普通髓系祖细胞分化为终末细胞的过程有着密切联系，并且在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞中的表达量最高。此外，由于终末细胞死亡数量增加，造血干细胞中Morrbid的缺失会导致短寿命髓样细胞数量的减少。研究结果还显示，Morrbid主要表达于细胞核，并且Morrbid缺失的RNA分析结果表明，它可以以顺式调节作用抑制其邻近基因Bcl2l-11的表达(Bcl2l-11编码促凋亡分子Bim)[12]。

在普通髓系祖细胞或单核细胞向DCs分化过程中，lnc-DC的表达明显上调，且在淋巴样和非淋巴样经典DC亚群中表达量最高。lnc-DC缺失则可抑制DC特异性基因编码产物CD40、CD80、CD86和CCR7的上调，进而影响抗原提呈、T细胞活化和细胞迁移[13]。与Morrbid不同的是，lnc-DC主要在细胞质中与DC关键转录因子STAT3相互作用，lnc-DC可与STAT3的羧基端结合，促进STAT3的磷酸化和核位移。通过对DCs中与STAT3结合的其他蛋白分析发现，lnc-DC的缺失可导致STAT3和SHP1之间的相互作用增加，Tyr705处的STAT3磷酸化程度降低，引发STAT3核位移减少。lnc-DC的过表达则可降低STAT3和SHP1之间的相互作用，引发更多STAT3进行核位移。因此，lnc-DC可通过控制DC关键转录因子的翻译后修饰来调控DC的分化[13]。

4 lncRNA对CD4+T细胞分化的调节

CD4+T细胞分化为辅助T细胞亚群对于启动机体适应性免疫调节反应至关重要。通过研究T细胞亚群中RNA表达发现了受特征性Th2细胞转录因子GATA-3调控的lincR-Ccr2-5′AS[14]。当lincR-Ccr2-5′AS表达缺失后，发现在Th2细胞中近1 200个基因的表达受到影响，而且这些基因主要是GATA-3依赖性基因，尤其是编码关键Th2细胞趋化因子(Ccr1、Ccr2、Ccr3和Ccr5)的基因簇上调最为明显。此外， lincR-Ccr2-5′AS在Th2细胞中的表达缺失还可导致其迁移至肺的能力严重受损。通过对人Th2细胞的研究发现，从RAD50位点转录的lncRNA Th2-LCR具有与其类似的调节功能，调控着Th2细胞中其相邻基因簇细胞因子IL4、IL5和IL13的转录[15-16]。

此外，Th17细胞的分化也依赖于lncRNA与特征转录因子相关的转录。Th17细胞转录因子RORγt的功能性伴侣分子是DEAD-box RNA解旋酶DDX5，与野生型细胞相比，DDX5缺陷鼠Th17细胞产生的IL-17A更少，并且RORγt靶基因(包括Il17a、Il17f、Il22和Il23r)的表达水平也较低。因此，在自身免疫性结肠炎的小鼠模型中，体内移植缺乏DDX5的T细胞不能诱导Th17细胞驱动的器官炎症反应，进而导致共表达IL-17A和IFN-γ(IFN-γ)的肠道CD4+RORγt+T细胞数量减少。研究结果表明，DDX5的功能依赖于蛋白质中RNA螺旋酶成分，这表明关键RNA介导了其功能[17]。

还有，在Th1细胞中lncRNA linc-MAF-4可抑制Th2细胞转录因子MAF的表达，从而促进T细胞向Th1细胞系分化。其机制是linc-MAF-4和MAF的基因组区域形成了长距离的染色体接触，使linc-MAF-4招募染色质重组子EZH2和LSD1至MAF启动子进而抑制其转录。因此，抑制linc-MAF-4将促使T细胞向Th2细胞系分化。这些对辅助性T细胞的研究表明，lncRNA可作为细胞特异性效应程序的关键调控因子[18]。

5 lncRNA在炎症激活中的作用

先天免疫反应是由几个功能不同的髓系细胞所驱动，包括树突状细胞和巨噬细胞，它们通过模式识别受体鉴别病原体并启动免疫反应。已经从基因转录、转录后蛋白修饰和染色质可及性水平确定了lncRNA在这一反应中的关键调节功能。总之，lncRNA的表达模式和功能在病原体应答途径中具有高度特异性[19-20]。当Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)TLR1和TLR2或TLR7和TLR8被激活后，DCs和巨噬细胞中lincRNA-COx2的表达可上调1000倍。研究显示，lincRNA-COx2的转录依赖TLR调节蛋白MyD88和转录因子NF-κB的信号转导[19]。因此，在炎症刺激过程中，lincRNA-COx2的缺失导致了500个以上炎症编码分子表达变化，表明lncRNAs可协同调节大部分基因的特异性表达。

实际上，在正常情况下，lincRNA-Cox2也可抑制数百个炎症编码分子的激活，主要包括参与炎症反应Tlr1、Il6、Il23a和趋化因子Ccl5和Cx3cl1，以及干扰素刺激分子Irf7、Oas1a和Oas1l等。lincRNA-Cox2调控基因的表达机制是通过与异构核糖核蛋白hnRNP-A/B(Hnrnpab编码)和hnRNP-A2/B1(Hnrnpa2b1编码)的相互作用来实现[19,21]。hnRNPs是一种大的核RNA结合蛋白，参与RNA的剪接、稳定和转运以及基因的转录和翻译。与此相同的是，hnRNPs可以抑制p53诱导的lncRNA的表达，与敲除 lincRNA-Cox2功能相似，骨髓来源的巨噬细胞中Hnrnpab和Hnrnpa2b1的缺失可导致一组编码炎性分子的基因表达失调。此外，巨噬细胞中敲除Hnrnpab或Hnrnpa2b1后，过表达lincRNA-Cox2则可逆转Ccl5的抑制作用，提示这些分子具有协同调节作用[22]。

在TLR信号通路中lncRNA-THRIL也是通过RNA与hnRNP蛋白结合发挥调节作用。通过对人巨噬细胞系THP-1基因表达筛选结果表明，激活TLR2大约诱导了159个lncRNA的表达。转录组分析发现，THRIL缺失后，包括TNF、IL8、CXCL10、CCl 1和CSF1在内的大约有300多个TLR2下游基因均存在表达变化。与lincRNA-Cox2的功能相似，THRIL也能调控炎症编码基因的表达。并且质谱研究结果进一步证实了THRIL和hnRNPL之间的特定相互作用，hnRNPL敲除后可导致巨噬细胞中TNF表达量降低，说明这两个分子是以复合物的形式发挥作用。通过对THRIL的染色质分离分析证明了其与TNF基因组位点之间存在着关联性，并且hnRNPL是以依赖于THRIL的方式在TNF启动子内的一个区域富集[23]。这些数据显示THRIL可将hnRNPL招募到特定基因组位点，以调节TLR刺激的基因转录。

研究显示，与脂多糖刺激反应相关的lncRNA PACER以充当NF-κB信号通路诱饵的方式调节特异性炎症编码反应介质环氧合酶2(COX-2)基因PTGS2的表达。PACER通过与NF-κB亚基p50结合并将其与PTGS2启动子隔离而发挥调节作用。PTGS2启动子中p50-p50同型二聚体可以抑制转录，进而导致P50自由亚基的可用性降低，引发p50转录激活异源二聚体和NF-κB组分p65(RelA)的替代生成和转录前起始复合物向PTGS2启动子募集[24]。在研究X染色体失活过程中，已证明有类似的“lncRNA诱饵原型”存在。在X染色体失活的起始阶段，Jpx通过与抑制转录因子CTCF (CCCTC-binding factor)结合并降低其活性来开启Xist表达[25]。

6 lncRNA限制炎症反应

lncRNA在调节炎症过量反应方面发挥着重要调节作用[26]。经IL-1β和TNF刺激后的小鼠胚胎成纤维细胞，假基因LncRNA Lethe的表达与NF-κB呈显著负相关，过表达Lethe后导致NF-κB活性降低。RNA免疫沉淀分析结果显示，Lethe通过与p65(RelA)核同型二聚体特异性结合而阻止其在靶基因位点(包括NF-κBIa、IL-6和IL-8)的聚集[27]。因此，Lethe可充当NF-κB的诱饵受体，随免疫系统的激活而提供负反馈以限制炎症反应。

两项研究已经证实lncRNA可通过与染色质直接相互作用发挥抑制炎性分子基因表达的功能[28-29]。如lincRNA EPS可在红细胞、巨噬细胞和DCs中表达，但先天免疫系统激活后其在巨噬细胞和DCs中的表达明显下调，并且LincRNA EPS缺失鼠并无红细胞发育缺陷现象的产生，而是在体内表现出超强的免疫反应。在静息状态或TLR配体刺激后，lincRNA-EPS缺失鼠中骨髓源性巨噬细胞中炎症编码基因(包括Il6、Cxcl10、Ccl4和Irg1)的表达明显高于野生型对照组[28]。其结果表明，这种表观基因组的改变主要发生在静息状态的巨噬细胞，与RNA表达动力学一致，当免疫系统受到刺激后随之消失。此外，lincRNA-EPS也可通过在细胞核中与hnRNPL结合后发挥相应调节功能。这些发现表明，lincRNA-EPS可通过控制染色质可及性和核小体定位来抑制髓系细胞中应答基因的表达。

lnc13对抑制免疫系统中基因的转录具有相似的功能，巨噬细胞中lnc13的表达经TLR4活化后下调，并在细胞核与hnRNPL和组蛋白去乙酰化酶HDAC1形成RNA -蛋白质复合物发挥其调节作用，抑制一组包括Myd88、STAT1、STAT3和TNF在内独特的编码免疫反应分子。此外，lnc13具有与腹腔疾病相关的单核苷酸多态性功能，在体外转录与腹腔疾病相关的等位基因的lnc13形式可以抑制其与hnRNPL的结合[29]。因此，lnc13在腹腔疾病患者中表达较低，进而上调了其靶基因表达水平，提示单核苷酸多态性可能是lnc13调节与炎症相关疾病发展的重要基础。

lncRNA NKILA也可在转录后水平负调控NF-κB信号传导。IL-1β或TNF刺激后，乳腺癌细胞中NKILA显著上调。与Lethe相似，NF-κB活性随NKILA消失而增强，随NKILA上调而降低。生物学分析研究表明，NKILA通过与NF-κB及其负调节因子IκB(NF-κB抑制剂)形成RNA-蛋白复合物，直接屏蔽了激酶IKK(IκB激酶)的IκB磷酸化基序，抑制了 IKK对IκB的磷酸化和降解，促使NF-κB在细胞核中滞留[30]。

7 lncRNAs在细胞活化中的调节作用

lncRNA NeST(Tmevpg1)属于基因间lncRNA，位于与神经性泰勒病毒持久性感染相关的基因组区域，也是第一个被发现可以调节体内免疫应答反应的lncRNA分子。分析显示，B10.S小鼠不感染泰勒病毒，而SJL/J小鼠易受持续感染，且易感性表型仅包含编码Nest(Tmevp3)、IFN-γ(IFNG)和IL-22(IL22)的基因组区域。基因表达分析表明，Nest在SJL/J株位点小鼠的T细胞中显著表达，而且在B10.S小鼠中过表达Nest能显著增加对泰勒病毒的易感性[31]。进一步研究发现，Nest可在CD8+T细胞、CD4+Th1细胞和自然杀伤细胞中表达，并依赖于转录因子T-BET、STAT4和NF-κB的结合活性。再加上NeST与IFN-γ基因座相邻，表明NeST可通过调节IFN-γ的转录而影响对病原体的反应。相同的是，NeST的同源或转基因表达增加了活化CD8+T细胞中IFN-γ的产生[31]。从机理上讲，NeST通过与WDR5结合并以反式调节作用向IFN-γ启动子序列募集转录激活复合物来诱导IFN-γ转录。这些研究揭示了lncRNA在体内T细胞中的调节功能及其在病毒感染后免疫系统反应中的关键调节作用。

在抑制T细胞过度活化方面lncRNA也发挥着非常重要[32]。通过短发夹RNA的体外筛选结果表明，lncRNA NRON可作为钙依赖性转录因子NFAT激活的抑制剂。免疫共沉淀结果显示，NRON在静息T细胞中形成一个大的RNA-蛋白质复合物，它在细胞浆中能够隔离NFAT磷酸化形式[33]。除此之外，RNA-蛋白质复合物还包括钙调素结合蛋白IQGAP1、激酶LRRK2和核转运因子核素β1。在T细胞抗原受体受到刺激后，NRON复合体中NFAT与之解离，并被Ca2+——钙调蛋白依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶脱磷酸化，然后转运到细胞核中激活转录。因此，NRON的缺失可导致NFAT去磷酸化和NFAT核位移及T细胞活化后的细胞因子产生[34]。此外，基于对LRRK2缺失鼠的研究发现， LRRK2能够稳定NRON-NFAT关联性，LRRK2的缺失通过促使NFAT核位移增加，导致下游靶基因的表达。值得注意的是，LRRK2缺失还会导致患有结肠炎的实验小鼠体重减轻和临床症状加重，结肠炎性浸润增强，炎性细胞因子表达增多等现象[35]。

在CD8+T细胞中，lncRNA-CD244在限制T细胞激活方面有着类似的调节功能。lncRNA-CD244的诱导表达是通过T细胞抑制性受体CD244(2b4) 而实现，同时介导了IFN-γ和TNF基因的表达抑制。与linc-MAF-4类似，lncRNA-CD244与EZH2相互作用并将其募集到IFN-γ和TNF启动子中，以沉积抑制性染色质标记。而通过降低lncRNA-CD244可以改善CD8+T细胞在体内的功能。在结核分枝杆菌感染模型中的研究表明，移植缺失lncRNA-CD244的CD8+T细胞可导致小鼠器官对细菌的感染性明显降低[36]。

8 展望

免疫系统在维持器官内环境平衡和预防自身免疫的同时，也对致病性入侵产生了强烈的反应。lncRNA参与了免疫细胞发育的多个阶段和病原体应答途径，是调节这一过程的重要参与者。为了区分外源性威胁和自身内环境的稳定状态，免疫系统通过检测、放大和对细胞刺激作出反应的大分子来响应外界环境信号的变化。而lncRNA参与了免疫细胞发育的多个阶段和病原体应答途径，是调节这一过程的重要参与者。尤其是近年来转录组学技术的发展，进一步增强了对体内外lncRNA功能的理解和认识。因此，对lncRNA的持续研究将不断有新的发现，并为人类疾病和感染提供更好的治疗方法。