沙尘暴PM2.5对小鼠心肌基质金属蛋白酶表达的影响

王立君 韩俊先 华永芬 王晨晨 李星辉 谢萍

大气颗粒污染物与心血管系统疾病的相关性近年来受到关注。PM2.5是粒径≤2.5 μm的颗粒和液滴，是常见的大气污染物。流行病学研究发现，PM2.5水平与心血管疾病死亡有一定联系[1]。PM2.5会引起炎性反应并加速动脉粥样硬化，影响血管功能，引发心血管疾病。基质金属蛋白酶(MMP)为含锌内肽酶家族，可以调节血管细胞外基质(ECM)的降解，参与动脉硬化斑块产生和破裂[2-3]。MMP-2和MMP-9为降解弹性胶原的主要成分，与平滑肌细胞迁移和增殖密切相关，可促进动脉硬化发生发展[4]。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)是体内MMP的天然特异性抑制剂，它可通过共价键与MMP结合，并与MMP共同维持ECM的动态平衡。ECM动态平衡的破坏可促进动脉粥样硬化斑块的形成和破裂[5-7]。本研究旨在建立沙尘暴PM2.5暴露模型，探讨PM2.5对MMP-2、MMP-9及TIMP表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 PM2.5收集及PM2.5溶液的配制

2018年4月沙尘暴频发，在河西走廊非工业区使用EOM1405D双通道颗粒物监测仪采集沙尘颗粒，PM2.5来自系统可更换的TEOM滤膜。将滤膜裁剪成1 cm×3 cm小片，放入超纯水中，超声下震荡处理0.5 h，共3次。震荡液经纱布过滤，所得滤液在冷冻后进行真空干燥处理，获得PM2.5粉末，置入-20 ℃冰箱保存。使用无菌生理盐水配制PM2.5溶液，配制时精确称量PM2.5粉末量，超声处理15 min进行混匀。

1.2 沙尘暴PM2.5 暴露模型的建立

将36只雄性6周龄ApoE基因敲除小鼠随机分为对照组、PM2.5低剂量暴露组、PM2.5中剂量暴露组、PM2.5高剂量暴露组，测量小鼠心率、体质量、体温等指标。10%水合氯醛麻醉小鼠，仰卧位固定，消毒处理后在颈前正中切口，切口长度约1 cm，组织分离后暴露气管，刺入针头后滴入PM2.5溶液，PM2.5低、中、高剂量暴露组的PM2.5溶液浓度分别为1.6、8.0、40.0 mg/L，滴入量为0.15 mL/100 g，对照组注入生理盐水，注入量为0.15 mL/100 g，每日滴注1次。饲养20周后脱颈椎处死小鼠，获取心脏组织，-80 ℃低温保存。

1.3 Westernblot检测MMP-2、MMP-9和TIMP的蛋白表达水平

RIPA缓冲液裂解蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脱脂乳室温封闭2 h，MMP-2、MMP-9、TIMP一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL染色后，于凝胶成像仪中成像。通过ImageJ软件对条带进行灰度值分析，计算蛋白相对表达水平。

1.4 实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMP-2、MMP-9和TIMP的mRNA表达水平

Trizol法提取RNA，紫外分析仪检测RNA浓度。将RNA反转录为cDNA后，进行SYBR Green荧光定量RT-PCR。MMP-2引物序列：上游5′-CAACGGTCGGGAATACAGCA-3′，下游5′-TGGTAAACAAGGCTTCATGGG-3′。MMP-9引物序列：上游5′-TGGTCTTGGAACAGGAGCAAA-3′，下游5′-ACATTCAGTGGTCTCAGCCTTT-3′。TIMP引物序列：上游5′-CTGGCATCTGGCATCCTCTT-3′，下游5′-GGGAACCCATGAATTTAGCCC-3′。PCR反应条件：95 ℃初始变性5 min，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间差异比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌细胞MMP-2的表达水平比较

4组MMP-2的mRNA及蛋白表达水平均有统计学差异(P均<0.05)。两组间比较，PM2.5低剂量暴露组MMP-2的mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组，PM2.5中剂量暴露组MMP-2的mRNA及蛋白表达水平明显高于PM2.5低剂量暴露组，PM2.5高剂量暴露组MMP-2的mRNA及蛋白表达水平明显高于PM2.5中剂量暴露组(P均<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠心肌细胞MMP-2的表达水平比较

2.2 各组小鼠心肌细胞MMP-9的表达水平比较

4组MMP-9的mRNA及蛋白表达水平均有统计学差异(P均<0.05)。两组间比较，PM2.5低剂量暴露组MMP-9的mRNA及蛋白表达水平明显高于对照组，PM2.5中剂量暴露组MMP-9的mRNA及蛋白表达水平明显高于PM2.5低剂量暴露组，PM2.5高剂量暴露组MMP-9的mRNA及蛋白表达水平明显高于PM2.5中剂量暴露组(P均<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠心肌细胞MMP-9的表达水平比较

2.3 各组小鼠心肌细胞TIMP的表达水平比较

4组TIMP的mRNA及蛋白表达水平均有统计学差异(P均<0.05)。两组间比较，PM2.5低剂量暴露组TIMP的mRNA及蛋白表达水平明显低于PM2.5对照组，PM2.5中剂量暴露组TIMP的mRNA及蛋白表达水平明显低于PM2.5低剂量暴露组，PM2.5高剂量暴露组TIMP的mRNA及蛋白表达水平明显低于PM2.5中剂量暴露组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠心肌细胞TIMP的表达水平比较

3 讨论

近年来，大气颗粒物污染有所加重，威胁人类健康。统计研究发现，在沙尘暴高发时期，受沙尘暴影响区域医院心血管疾病就诊人数大幅度增加，死亡率也明显升高[8]。大气颗粒物污染的相关研究主要针对呼吸系统毒性方面，较少针对心血管系统。

长期高浓度PM2.5暴露易引发血管内皮细胞损伤[9]，而内皮细胞损伤与动脉粥样硬化密切相关。血管内皮屏障相关的功能物质为ECM，ECM代谢平衡的打破会导致血管重构，显著增加动脉粥样硬化风险。MMP可通过特殊类型的连接蛋白结合ECM，进而降解ECM，在动脉粥样硬化的发生发展中发挥作用[10]。TIMP属于MMP的特异性抑制剂，可通过氨基端功能区的半胱氨酸残基结合活化的MMP，形成MMP-TIMP复合体，从而阻断MMP与底物的结合[11]。MMP与内源性抑制剂相互协同，调节细胞活化、增殖、迁移、凋亡、血管生成以及心肌ECM的动态平衡[12-13]。研究表明，小鼠血管内膜损伤时，MMP-2和MMP-9表达水平升高[14-15]，提示MMP可促进内膜增厚并加速血管平滑肌细胞迁移。在MMP-9缺失时，小鼠内膜细胞的生成也会出现异常或延迟。

MMP及其抑制剂TIMP是反映动脉粥样硬化进程的重要标志物，本研究主要分析暴露于不同浓度PM2.5时，MMP及TIMP表达的变化情况，以阐述ECM失衡对动脉粥样硬化疾病发生发展的影响及机制。结果显示，暴露于PM2.5的小鼠心肌细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平高于正常小鼠，TIMP的表达水平低于正常小鼠，且MMP-2、MMP-9的表达水平随小鼠PM2.5暴露浓度的增高呈上升趋势，TIMP的表达水平随小鼠PM2.5暴露浓度的增高呈下降趋势。研究结果提示暴露于PM2.5可以促进小鼠心肌细胞中MMP-2、MMP-9的表达，沙尘颗粒物浓度越高，小鼠动脉粥样硬化程度可能越重。

动脉粥样硬化是长期复杂的病变过程，影响因素较多。在甘肃河西走廊等沙尘暴高发地区进行冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)防治时，可以在减少大气颗粒物控制环境污染的同时，分析患者的MMP-2、MMP-9及TIMP表达水平，以深入探讨与ECM动态平衡破坏相关的冠心病的发病机制。