基于高通量测序的象山港海域黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)食性分析

孙 鹏,凌建忠,张 辉,唐保军,姜亚洲

中国水产科学研究院东海水产研究所,农业农村部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室, 上海 200090

黑鲷(Acanthopagrusschlegelii, Bleeker, 1854)隶属于鲈形目(Perciformes),鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus),为暖温性底层鱼类,栖息于近岸岩礁海区、内湾以及咸淡水水域,广泛分布于包括我国沿海在内的西北太平洋温暖水域[1],为我国东南沿海重要的捕捞品种和增养殖对象[2- 4]。象山港位于我国浙江中部沿海,是一个半封闭性港湾,其自然生态环境优良,是多种渔业资源的集中分布区,也是多种经济鱼类的繁殖、育幼场所[5- 6]。黑鲷是象山港的优势鱼种和重要捕捞对象,在生态系统物质循环和能量流动过程中起着重要作用[7]。近年来,象山港所面临的人为胁迫日趋严重,在此背景下保障黑鲷等重要物种的种群稳定对于该海域具有重要的生态和经济意义。

鱼类基础生态学研究是制定鱼类资源增殖养护策略的科学依据[8]。摄食习性作为基础生态学的重要研究内容,是了解不同鱼类间营养关系的基础,同时也是探讨摄食策略、评估鱼类生存状况和生态系统功能、构建栖息地选择模型等相关热点问题的重要依据[9- 12]。食性分析方法的准确性和精确性是影响分析结果应用价值的重要因素[13]。近年来,随着高通量测序技术的发展,该技术逐渐被应用到野生动物的食性分析中,有效提升了食性分析的效率,拓宽了食性分析的应用范围,并在数据量、灵敏度和分辨率方面较传统的食性分析方法显现出一定的优势[14]。

针对黑鲷食性研究的薄弱现状,以象山港采捕黑鲷个体为研究对象,以18S rDNA为靶标,利用Illumina Miseq高通量测序方法探究黑鲷饵料生物组成特征,分析不同龄组黑鲷食性的异同,以期在丰富象山港黑鲷摄食生态学认知的同时,为制定该海域黑鲷资源增殖养护措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

实验所用样品为2019年3至4月份通过桁杆拖网和流刺网收集于浙江宁波象山港海域的黑鲷渔获样本,本次研究共选取其中21尾用于食性分析。为保持样品新鲜及胃含物不被进一步分解,捕捉后立即使用丁香酚麻醉处死并于现场进行常规生物学测量(体长、体重、性别、胃重、空胃重等),随即解剖取得胃含物于干冰中保存备用。与此同时,采集矢耳石用于年龄鉴定。参考海洋调查[15]规范将黑鲷渔获样品摄食强度分为5级(0级—4级),分别对应空胃、食物不超过胃腔50%、食物超过胃腔50%、食物充满不膨胀和食物充满胃腔并且膨胀等五种状态。对胃饱满度高的黑鲷个体,将含量较多的食物物种进行单独称重,再从其中定量选取一部分与其他含量少的物种一起混合保存于无菌离心管中；对胃饱满度较低的个体,将所有胃含物一起收集；称量并记录离心管中样品重量；对空胃个体取其胃内粘液进行测序分析。实验黑鲷样品的生物学信息如表1所示。

表1 黑鲷样品基础生物学信息

1.2 DNA提取

胃含物在实验室中经磷酸盐缓冲液(pH 7.2—7.6)冲洗后进行匀浆处理。充分匀浆后的胃含物经定量后采用海洋生物DNA提取试剂盒(北京天根)并参照说明书进行总DNA提取。所得总DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,并采用紫外分光光度计定量,随后于-20℃保存备用。

1.3 Illumina Miseq高通量测序

使用扩增片段约为420 bp的通用引物547F：5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC- 3′和V4R：5′-ACTTTCGTTCTTGATYRA- 3′[16]对18S rDNA V4区域进行扩增。PCR反应在一个20 μL体系中进行,反应体系如下：5×缓冲液4 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 正反引物(5 μmol/L)各1 μL,Q5高保真Taq酶(NEB,北京) 0.5 μL,DNA模板10 ng。PCR程序为：95℃预变性7min,95℃变性45 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,最后72℃延伸10 min,反应循环数为29。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测和纯化后,在 Illumina Miseq测序平台(Illumina,美国)进行双端测序。

1.4 数据分析

下机数据经过初步筛选并去除嵌合体后得到有效数据。应用QIIME软件对序列按照97%的序列相似度进行归并和操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)划分,再选择OTU中的代表性序列与Silva数据库(http://www.arb-silva.de/)进行物种注释分析以及黑鲷自身序列剔除,并结合象山港海洋各生态类型水生生物分布信息对所注释物种进行人工校对[5]。并运用QIIME软件对所得OTU进行聚类以分析不同样品胃含物的物种组成。通过OTU分析可得出饵料生物的多样性和不同物种的相对丰度。

为分析不同龄组黑鲷饵料生物组成的差异,基于上述高通量测序结果,建立“个体×饵料生物相对丰度”矩阵,基于聚类分析对不同龄组黑鲷个体的饵料生物组成进行二维排序,并利用相似性分析检验(Analysis of similarities,ANOSIM)检验不同龄组黑鲷饵料生物组成差异的显著性[17-18]。为权衡稀有物种和优势物种的权重,在进行多元分析前,对原始数据进行了4 次方根转化[19]。

2 结果

2.1 OTU划分与分类地位鉴定

经Illumina高通量测序共从21个样品中获得长度约为420 bp的目的片段913254条,样品的序列数目最低为30826条,最高为52374条,平均序列数为(43488±5843)条。21个样品经过聚类共获得554个OTU,不同样品中含有OTU数目差异较大,其OTU划分和分类地位鉴定结果参见表2。

表2 可操作分类单划分和分类地位鉴定结果统计表

图1所示为黑鲷胃含物样本所含饵料生物相对丰度前20位的分类单元的总体分类等级树图。以不同颜色区分各分类单元,并通过节点大小反映它们的相对丰度分布,可直观反应黑鲷饵料生物的优势类群。本研究利用高通量测序方法共在黑鲷胃含物中鉴定出9个门类的62种饵料生物,这些饵料生物分属于41个属。其中,软体动物门(Mollusca)、节肢动物门(Arthropoda)和绿藻门(Chlorophyta)的相对丰度较高,其次是脊索动物门(Chordata)、扁形动物门(Platyhelminthes)、硅藻门(Bacillariophyta)和环节动物门(Annelida),线虫动物门(Nematoda)的相对丰度较低,此外还有部分OTU未能归属到已知分类单元。

图1 黑鲷饵料生物的总体分类等级树Fig.1 General classification tree of prey items for the black sea bream

2.2 黑鲷饵料生物组成

表3列举了相对丰度排序前20位的黑鲷饵料生物种类。从饵料生物出现频率和相对丰度分析,石莼(Ulvalactuca)、熊本牡蛎(Crassostreasikamea)、胸刺水蚤(Centropageshamatus)、日本蟳(Charybdisjaponica)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)和褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)是象山港黑鲷最重要的饵料生物种类,其在黑鲷胃含物中不仅出现的频率较高,而且相对丰度较大,6个种类合计占据的黑鲷饵料生物相对丰度比重高达60.90%。此外,还有部分饵料生物虽相对丰度较高但出现频率较低,如小刀蛏(Cultellusattenuatus)、平角涡虫(Planoceramultitentaculata)、粗尾沟藻(Torodiniumrobustum)、尖尾全沟藻(Teleaulaxacuta)和海洋线虫(Chromadorinasp.)等仅出现于单个样品中。

从饵料生物组成类型上看,象山港海域黑鲷食性较为复杂,摄食对象包含大型藻类(石莼等)、贝类(熊本牡蛎和毛蚶等)、浮游动物(胸刺水蚤等)、浮游植物(尖尾全沟藻等)、底栖动物(沙蚕Dendronereissp.等)、鱼类(褐菖鲉等)和蟹类(日本蟳等)等多个海洋生物类群,黑鲷展现了较为典型的杂食性特征。

表3 黑鲷主要饵料物种的出现频率和相对丰度百分比

2.3 不同龄组黑鲷食性特征

在1至4龄组黑鲷样品中检出并鉴定饵料生物种类数分别21、23、23和17种。其中,石莼、熊本牡蛎、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉等重要饵料生物种类在4个龄组黑鲷样本中均有分布,上述种类在各龄组黑鲷饵料生物相对丰度中的占比为44.3%—77.8%。各龄组黑鲷优势饵料生物种类组成略有差异,如1龄黑鲷个体优势饵料生物为胸刺水蚤(31.52%,相对丰度百分比,下同)、石莼(22.13%)和日本蟳(13.72%)；2龄黑鲷个体优势饵料生物为日本蟳(21.16%)、锉蛤(19.65%)和石莼(16.04%)；3龄黑鲷个体优势饵料生物为褐菖鮋(18.42%)、毛蚶(18.30%)和石莼(10.80%)；4龄黑鲷个体优势饵料生物为熊本牡蛎(58.21%)、石莼(8.35%)和褐菖鮋(3.44%)。

聚类分析结果如图2所示,象山港黑鲷个体的饵料生物组成并未呈现明显的龄组差异格局(横坐标表示个体的年龄)。相似性分析检验(ANOSIM)结果也显示：不同年龄组黑鲷的饵料生物组成差异尚未达到显著性水平(R=0.014,P=0.446)。

图2 不同龄组黑鲷个体饵料生物组成的聚类分析图Fig.2 Cluster of prey composition in black sea bream of different ages

3 讨论

鱼类营养供应是决定其生长发育的关键因素,也是影响渔业资源可持续产出的重要因子。食性分析方法的准确性和精确性直接关系到食性相关理论的探索,同时也关乎研究结果在鱼类保护实践过程中的应用。黑鲷是我国近海重要的增殖养护对象,其增殖养护措施的精细化设置需要食性特征等基础生态学理论的支撑。目前,国内关于黑鲷在自然海域摄食习性的研究仅见于柏怀萍[20]等利用胃含物分析法的相关研究报道,胃含物分析法虽具简便易操作的特点,可对个体较大且消化程度较低的胃含物直接根据形态特征加以判别,但对消化较为充分的胃含物则仅能通过耳石、眼珠、残肢等一些难以消化的残留物进行鉴定,精确性存在较大欠缺[21- 24]。近年来,食性分析方法也在不断改进和更新[25-29],高通量测序法因其高效性受到研究人员的青睐。本研究利用高通量测序法在鱼类食性分析过程所具备的高灵敏度的技术特点,对象山港黑鲷的饵料生物组成进行探索研究,研究结果可为准确、系统掌握黑鲷摄食习性提供有益补充。

与传统的胃含物分析结果相比[23-24],高通量测序法所检测到的黑鲷主要饵料生物种类组成相似,但高通量测序法具有明显的样品需求少、工作量小和检出物种多的特点。此外,借助于高通量测序法的灵敏性高的特点,本研究从消化程度较高的空胃黑鲷胃部粘液样品中检测鉴定得到石莼、浒苔、日本蟳、熊本牡蛎、胸刺水蚤、毛蚶以及多种藻类饵料生物种类,并鉴定出部分传统胃含物分析法未能检测到的微藻和小球藻等相对丰度较低的黑鲷饵料生物种类,高通量测序法在黑鲷等杂食性鱼类摄食生态研究中显现出较为明显的技术优势[23]。此外,发现18S rDNA的保守性以及目前按照97%的序列相似度进行归并的分析标准也会影响到高通量测序对某些物种鉴别的精准度,对此可考虑将克隆测序法与之相结合以达到更优的鉴定结果；而本次研究过程中基于已有的象山港海区资源调查名录,将序列比对所得的注释物种加以人工校对也显著地提高了所鉴定物种的准确性。相信随着测序技术以及数据分析技术的快速发展,高通量测序技术在鱼类食性研究中将具有更广阔的应用前景。

结果显示,黑鲷摄食种类范围较广,仅本次分析就在黑鲷胃含物中鉴定出9个门类中的62种饵料生物,这些饵料生物分属于大型藻类、贝类、浮游动物、浮游植物、底栖动物、鱼类和蟹类等多个海洋生物类群,黑鲷展现了较为典型的杂食性特征。石莼、熊本牡蛎、胸刺水蚤、日本蟳、毛蚶和褐菖鲉是象山港黑鲷优势饵料生物种类,其中石莼、熊本牡蛎和褐菖鲉均为典型的岩相生境分布物种,其对应的分布水域与黑鲷(礁栖鱼类)基本一致,是象山港黑鲷的主要饵料供给对象[30]。

早期黑鲷调查发现,黑鲷幼鱼和成鱼食性存在差异,其中幼鱼以环节动物和虾类为主要食物类群,而成鱼以藻类、环节动物、甲壳类和贝类为主[20]。结果表明,1龄黑鲷个体优势饵料生物为胸刺水蚤、石莼和日本蟳；2龄黑鲷个体优势饵料生物为日本蟳、锉蛤和石莼；3龄黑鲷个体优势饵料生物为褐菖鮋、毛蚶和石莼；4龄黑鲷个体优势饵料生物为熊本牡蛎、石莼和褐菖鮋。由此可见,其主要饵料物种组成与之前调查结果相似。由于本次研究所捕捉黑鲷个体均为1年龄以上的成鱼,故未能对幼鱼食性进行分析比较。而对本次不同年龄组之间的比较发现1至4龄黑鲷个体的摄食食性有所差别,其中1龄和2龄个体中优势饵料生物相似性较高,而3龄和4龄个体中的优势饵料生物相似性较高。同时,我们结合黑鲷年龄和体长特征,利用相似性分析检验(ANOSIM)检验了不同年龄组黑鲷成鱼个体的饵料物种分布特征,但结果显示不同年龄组黑鲷饵料物种组成并无显著性差异。考虑到本次研究分析所用的黑鲷个体数量有限,这可能会影响到黑鲷不同龄组间的饵料物种差异分析；同时,由于鱼类摄食受自身生长和环境饵料生物组成等诸多因素的影响,黑鲷样品所处的具体生活环境也可对饵料物种组成造成影响,如本次检出物种中虾类和螺类样品较少,且部分其他食物种类也与传统方法鉴定结果存在一定的差异。鉴于上述情况,建议在后续研究中适当扩充黑鲷样品采集范围(包括取样季节、样品规格、采集区域和样品数量等),并结合样品采集水样的生物和环境信息,系统分析黑鲷摄食对象、摄食策略等营养生态特征,以期为科学制定黑鲷增殖养护措施、保持黑鲷物种种群稳定性提供科学依据。