分子标记物在禽类粪便污染溯源中的研究及应用进展

梁红霞,余志晟,*,刘如铟,张洪勋,吴 钢

1 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 100049 2 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085

近年来,家禽的出栏量和存栏量在我国所有畜禽中排第一位[1],这导致了大量禽类粪便的产生。大量的禽类粪便排入环境水体中,造成水质的不断恶化[2- 4]。将家禽粪便作为肥料用于土地中的事件也屡有报道,这也会增加土壤污染的风险[5]。而且,禽类粪便中携带的各种细菌和病毒也会威胁人类的身体健康[6-7]。禽类粪便可能会对水体和土壤环境以及人类健康造成的不利影响,因此快速准确的识别粪便污染并及时控制污染源对于环境保护和人类健康至关重要。

传统的粪便污染指示菌,如大肠杆菌、肠球菌等在人和温血动物肠道微生物群落中为优势菌,因此常用于指示水质状况[8]。但是,它们在水体污染溯源检测方面存在一定的局限性[9]。比如,对宿主特异性低导致不能准确指示污染来源[10-11],可以在体外繁殖而无法反映水体近期的污染情况等[12-13]。为了准确判断粪便污染物的来源,研究人员利用人和动物胃肠道中的微生物设计出具有特异性的标记物以检测粪便污染的来源,并称之为微生物溯源技术(Microbial source tracking, MST)[14-15]。微生物溯源标记物开发的基本前提为,(1)粪便源指示微生物在特定的宿主肠道内为优势菌且与宿主密切相关；(2)这些微生物存在宿主特异性序列且该序列可以设计为宿主粪便污染的标记物[16]。另外,指示标记物在排放环境中的赋存周期、行为也是需要考虑的因素[17]。

为了快速准确地检测来自禽类粪便的污染以减少其对环境和人类健康的影响,针对不同禽类的粪便污染标记物已经被开发,包括家禽(如鸡(Gallusgallus)[18]、鸭(Aixsponsa)[5]和鸽子(Columbalivia)[19])和野鸟(如加拿大雁(Brantacanadensis)[20]、海鸥(Laruscanus)[3]和沙丘鹤(Gruscanadensis)[21]等)。但是,随着禽类标记物种类和数目的增加,研究人员难以快速准确地选择出指示效果最好的禽类标记物用于粪便污染的检测。本文在前人研究基础上,对禽类微生物溯源标记物的开发和研究进展进行归纳和总结,为禽类标记物的快速选择提供一定的理论支持,为禽类微生物溯源技术在我国的发展和应用提供参考。

1 禽类微生物溯源标记物的性能评价

目前,多种禽类标记物已经被设计用于检测来自家禽(如鸡、鸭和鸽子等)和野鸟(如海鸥、加拿大雁和沙丘鹤等)的粪便污染(表1)。禽类标记物可分为通用标记物和特异性标记物,通用标记物用于检测所有禽类的粪便污染,而特异性标记物用于特定禽类的检测。一般地,可使用敏感性(Sensitivity)和特异性(Specificity)来衡量标记物的指示效果[14]。敏感性指标记物在目标宿主粪便样品中的阳性率；特异性指标记物在非目标宿主粪便样品中的阴性率。敏感性和特异性的数值越大,表明该标记物的指示效果越可信。敏感性和特异性的计算公式如下：

(1)

(2)

式中,TP(True positive)指标记物显示阳性的目标宿主粪便样品的数量；FN(False negative)指标记物显示阴性的目标宿主粪便样品的数量；TN(True negative)指标记物显示阴性的非目标宿主粪便样品的数量；FP(False positive)指标记物显示阳性的非目标宿主粪便样品的数量。

表1 家禽和野鸟的微生物溯源标记物

2 禽类微生物溯源标记物的发展

禽类微生物溯源标记物的设计来源主要为细菌16S rRNA基因、线粒体DNA和功能基因等(图1)。以细菌16S rRNA基因为设计来源的分子标记物具有广泛的应用,但有些禽类特别是野鸟会随季节的变化发生迁徙,其肠道微生物组成随宿主地理位置的变化而变化,使得设计出的标记物在不同区域的指示效果存在差别；线粒体DNA设计的禽类标记物多表现出高敏感性和高特异性的特征,且受宿主所在地理区域的影响较小,可广泛用于禽类的微生物溯源研究；尽管目前基于功能基因设计出的禽类标记物指示效果较差,但是使用功能基因设计禽类标记物的思路值得参考和借鉴。

2.1 细菌16S rRNA基因

在禽类微生物溯源研究中,最常使用的细菌是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌目(Bacteroidales)及其家族成员,其次是放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)及其家族成员。此外,也有一些种属信息尚未确定的源指示菌的16S rRNA基因用于禽类分子标记物的开发,如E2[33]和AV216[23]等。

2.1.1厚壁菌门及其家族成员

厚壁菌门及其家族成员在禽类的粪便样品中具有较高的相对丰度[23, 36]。Ohad等[23]基于家禽和水鸟粪便样品的16S rRNA基因高通量测序数据,针对在门水平上相对丰度为94%的厚壁菌设计出高特异性(99%)的禽类通用标记物AV43；针对在科水平上相对丰度为90%的乳酸杆菌(Lactobacillus)设计出敏感性和特异性分别为93%和97%的禽类通用标记物AV4143。

Catellicoccusmarimammalium属于肠球菌科(Enterococcaceae)。有研究表明C.marimammalium为海鸥粪便微生物群落中的优势菌,且在海鸥粪便中存在特异性序列[3]。研究人员基于C.marimammalium16S rRNA基因开发出的海鸥标记物Gull2[3]、Gull4[34]和Sketa[2],其敏感性和特异性均分别在71%和91%以上。但是,利用同属于厚壁菌门的链球菌(Streptococcusspp.)16S rRNA基因设计出的海鸥标记物Gull3,其敏感性仅为28%[34]。Green等[22]根据C.marimammalium16S rRNA基因开发的禽类通用标记物GFC,在64%的海鸥粪便样品中检出,但在其他禽类样品中的阳性率均不足5%。因此,C.marimammalium16S rRNA基因设计的标记物对海鸥表现出较高的宿主特异性,能够用于海鸥的微生物溯源研究中。

柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)属于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。因其严格厌氧,在体外不能繁殖且存活周期短的特点逐渐用于粪便污染研究中[37]。Shen等[30]通过比较不同动物粪便中的柔嫩梭菌属16S rRNA基因,在鸡粪便中发现一段特异性序列,并据此设计出敏感性和特异性分别为76%和100%的鸡粪源标记物IVS-p。另外,柔嫩梭菌属通用标记物和特异性标记物对鸡粪便污染的检测在我国珠江三角洲地区都得到了很好的验证[37-38]。目前,美国政府机构已经把Faecalibateriu检测方法纳入饮用水的辅助检测项目之中[39],说明柔嫩梭菌属在水质监测中的应用正逐渐受到重视。

图1 禽类微生物溯源标记物的分类Fig.1 Classification of avian markers for microbial source tracking

2.1.2拟杆菌目及其家族成员

拟杆菌(Bacteroides)是人和温血动物粪便微生物中的优势菌,其16S rRNA基因经常被用于设计人、哺乳动物和反刍动物的微生物溯源分子标记物[14],也有研究者将拟杆菌用于鸡[18]、鸭[18]和加拿大雁[20]等禽类微生物溯源研究中。但是,拟杆菌标记物在禽类微生物溯源研究中的指示效果一般,如在加拿大雁粪便样品中的敏感性低于60%[20],在鸡粪便中的检出率也低于75%[18, 25]。

拟杆菌在禽类粪便污染研究中指示效果差的原因可能如下, (1)拟杆菌在不同种类禽类的粪便微生物相对丰度差异较大,使得拟杆菌禽类通用标记物的设计很困难。Ohad等[23]发现拟杆菌在母鸡粪便细菌群落中的相对丰度为9.56%,但在水鸟中仅为0.1%；(2)拟杆菌在有些禽类肠道微生物群落并不是优势菌。有研究表明拟杆菌在部分禽类肠道和排泄物样品中几乎不存在,如水鸟[23]和海鸥[3]等。 Nshimyimana等[40]在新加坡的研究发现,通用拟杆菌标记物BacUni在人和哺乳动物粪便样品均有检出,但在鸟类粪便中均表现为阴性。总之,拟杆菌并不能准确地指示来自禽类的粪便污染。

2.1.3放线菌门、变形菌门和梭杆菌门及其家族成员

短杆菌(Brevibacterium)属于放线菌门,短杆菌科(Brevibacteriaceae)。Lu等[41]发现短杆菌在鸡垫料中为优势菌,且该菌暂未在其他禽类,如海鸥[41]、雪雁[21]和沙丘鹤[21]等粪便样品中发现。研究者利用短杆菌在鸡粪便中的16S rRNA特异性基因开发出鸡粪源标记物CL-TaqMan[28]和LA35[29]。Ryu等[28]使用鸡垫料和粪便样品对这两种标记物的指示效果进行测试,发现LA35和CL-TaqMan的敏感性在鸡粪便样品中均≤23%,但在鸡垫料样品中均≥98%。有研究报道鸡粪便和垫料样品的细菌群落结构存在差异[41-42],短杆菌属在鸡垫料样品是相对丰度最高的菌属之一[43],但在鸡的粪便和肠道样品中不存在或者少量存在[44-45],这可能解释了LA35和CL-TaqMan 在鸡垫料和粪便样品中的检出差异。总之,利用短杆菌属16S rRNA基因开发出的这两种标记物能够很好地指示鸡垫料的污染。

禽类通用标记物AV163[23]和GFD[22]分别由变形菌门分类下的卡氏杆菌属(Gallibacterium)和幽门螺旋杆菌属(Helicobacter)16S rRNA基因设计而来。其中,标记物GFD在中国、美国、新西兰和澳大利亚等多个国家进行过溯源研究[22, 46-47],但该标记物在不同国家的指示效果有所不同。比如,在美国的粪便样品中显示30%的敏感性[47],而在中国显示70%的敏感性[46]。对于在不同区域敏感性表现不同的标记物,使用前应进行预实验以判断其在本地的适用性。

图2 线粒体DNA的基本分子结构[48]Fig.2 The basic molecular structure of mitochondrial DNA[48]

禽类通用标记物GFB[22]、AV13[23]和AV24[23]均来自梭杆菌科(Fusobacteriaceae)16S rRNA基因。在引物设计者的研究中[22-23],这3个标记物的特异性均为100%,但是它们的敏感性均低于10%,或许其所对应的基因序列在禽类粪便微生物中相对丰度较低。总之,这些标记物不适用于禽类的微生物溯源研究中。

2.2 线粒体DNA

人类和动物肠道上皮细胞在肠道内脱落的过程中,肠道上皮细胞中的线粒体DNA会随肠道内容物以粪便的形式排出体外,所以人和动物粪便中均含有大量的线粒体DNA[48-49]。另外,线粒体DNA对宿主具有高度特异性[50-51],因此其逐渐运用于粪便污染溯源研究中[52- 54]。2005年,Martellini等[55]将线粒体DNA首次用于粪便污染微生物溯源中,实现了流域污染源的快速判断。

在禽类微生物溯源研究中,线粒体DNA的cytb基因常用于设计禽类标记物,其次是ND5基因、16S rRNA基因和ND2基因(图2)。Zhuang等[24]分别利用线粒体ND5和cytb基因开发出鸡和鸭粪便污染标记物,且设计出的标记物敏感性和特异性分别达到100%和≥85%,表现出良好的指示效果。Kortbaoui等[27]使用巢式PCR技术对线粒体16S rRNA基因设计的鸡粪源标记物进行指示效果评估,结果表明该标记物的特异性和敏感性均达到100%。

禽类特别是野鸟因季节性迁徙或觅食等因素,不会在同一区域长期停留。有研究表明饮食的改变和地理区域的差异会显著影响动物的肠道微生物群落组成[56-57],禽类所处的高度多样性的环境可能会影响其肠道微生物组成,使得禽类微生物溯源标记物的发展存在一定困难。但是,许多研究表明线粒体DNA不易受宿主的饮食状况和所在地理区域的影响[35, 50]。Liang等[58]使用中国5个不同区域的粪便样品对已有鸡源标记物进行系统评估后发现,以线粒体DNA为设计来源的鸡源标记物表现出最好的指示效果。本文归纳总结的标记物中(表1),利用线粒体DNA开发出的禽类标记物大多表现出高敏感性和特异性,所以线粒体DNA比细菌16S rRNA基因更适用于禽类微生物溯源标记物的开发。

2.3 功能基因

有研究表明与细胞有关的功能基因是宿主特异性实验的良好标记物[59],所以功能基因也能应用到粪便微生物溯源研究中。樊丽华等[60]发现能够编码某些细菌表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代谢蛋白的相关基因可作为猪特异性分子标记物设计的目标序列。

在禽类微生物溯源中,也有将功能基因作为特异性标记物的相关研究。Lu等[32]利用与细胞新陈代谢,细胞进程和信息的储存与处理等有关的基因设计禽类特异性标记物。比如,部分标记物对应的基因与新陈代谢有关,这些基因负责编码的细胞膜功能蛋白参与运输营养物质,包括碳水化合物(CP1- 26)、无机离子(CP1- 24 和 CP2- 9)和氨基酸(CP1- 55和CP3- 49)等。Hamilton等[61]基于宏基因组数据开发出加拿大雁特异性标记物GB2和GE11,这些标记物对应的基因负责编码粘附素细菌表面蛋白,该蛋白能够介导细菌对上皮细胞粘附、侵袭、细菌的自动聚集和生物膜的形成[62],为细菌在宿主肠道内的定殖起关键作用。

已开发的功能基因标记物对宿主的敏感性普遍较低。Lu等[32]利用21种动物的粪便样品对功能基因标记物的性能进行测试。在测试的鸡粪源标记物中,效果最好的标记物为CP2- 9,其敏感性仅为40%。Hamilton等[61]使用135份加拿大雁样品对标记物的敏感性测试,结果表明其敏感性均在20.7%到48.1%之间。虽然这些禽类功能基因标记物的敏感性较低,但是将功能基因设计为禽类标记物的研究思路具有很大的参考价值。

3 总结与展望

近年来,禽类微生物溯源的研究已经取得了很大的进展,针对家禽(如鸡、鸭和鸽子)和野鸟(如海鸥、加拿大雁和沙丘鹤)均设计出了相应的标记物。部分细菌16S rRNA基因标记物表现良好,如禽类标记物AV4143[23]和海鸥标记物Sketa[2]等；线粒体DNA不受宿主饮食和地理环境的影响,其对应的标记物大都表现出较高的敏感性和特异性,可重点用于禽类标记物的开发；利用功能基因进行标记物的设计也为禽类微生物溯源研究提供了新思路。

但是,禽类微生物溯源仍然面临较大的挑战。(1)许多禽类标记物并不是在我国发展而来,这些标记物在我国的指示效果并不可知,因此需要将现有禽类标记物在我国进行系统的比较以选择指示效果较好的标记物。(2)现有禽类标记物多表现为敏感性较低,所以应设计更多禽类标记物以准确检测禽类粪便污染。(3)现有溯源技术手段多表现为低通量,可将高通量数据溯源分析平台(如SourceTracker[63]和FEAST[64]等)应用到禽类粪便污染检测中。

致谢：中国科学院大学王波波博士帮助写作,特此致谢。