泛素化修饰功能在调节动物炎症机制中的研究进展

牛 慧 童津津* 熊本海 蒋林树

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

炎症是一种以防御为主的反应，能够阻止微生物感染和修复损伤组织[1]。然而，炎症也有负面影响，动物不同部位或器官的炎症引发不同的疾病，给动物养殖业造成的经济损失比较严重，如奶牛乳腺炎不仅会使奶牛产奶量降低，而且也会降低牛乳的质量[2]；奶牛子宫内膜炎会导致其繁殖力下降，诱发乳腺炎和真胃移位等疾病[3]；母猪阴道炎会使母猪配种返情，降低配种分娩力[4]；蛋鸡腹膜炎会造成产蛋率下降甚至蛋鸡死亡等[5]。因此，在动物饲养管理过程中，提高动物机体的免疫力，减少炎性疾病的发生是健康养殖的重点内容。

泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，广泛参与包括炎症信号转导在内的各种生理过程[6]。在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的作用下，泛素分子的C末端氨基酸通过异肽键与靶蛋白上的赖氨酸相连。此外，泛素分子通过自身的8个氨基酸残基(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)中的某一个与另一个泛素分子C端连接，形成不同键的多泛素链，每一个残基连接位点都会导致靶蛋白不同的结果[7]。K48介导的泛素化通常参与指导蛋白质进行蛋白酶体依赖性降解[8]，而K63介导的泛素化介导非蛋白降解的多种作用，例如调节DNA损伤修复、染色质结构改变、囊泡运输和蛋白激酶的激活等[9]。核转录因子-κB(NF-κB)家族是机体炎症反应和免疫应答的一个关键调控因子，参与调节许多免疫相关基因的表达，尤其是编码炎性细胞因子、趋化性细胞因子以及其他对免疫系统生长发育重要的基因[10]。此外，NF-κB途径诱导NLRP3炎性小体的激活，促进白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟与渗出，对于激活炎症的级联反应也是十分重要的[11]。本文围绕泛素化在NF-κB系统和NLRP3炎性小体激活中的调控作用进行综述，以期更好地调节机体的炎症反应，提高机体健康。

1 泛素化修饰对NF-κB系统激活的调控

NF-κB信号系统是指NF-κB二聚体、NF-κB抑制蛋白(I-κB)和I-κB激酶(IKK)(包含IKKα、IKKβ和NEMO)之间的相互作用[12]，它能响应多种刺激，如微生物病原体、炎性因子和自由基等。而泛素化在各种因素诱导的NF-κB系统激活中发挥着重要的调节作用。

1.1 病原体激活NF-κB中的泛素化调节作用

细胞是一道能有效抵御病毒、细菌和寄生虫等微生物病原体入侵的重要物理防线，其通过不同的模式识别受体(PRRs)检测微生物病原体相关分子模式(PAMPs)的类型，触发不同信号转导途径，启动炎症反应。Toll样受体(TLR)存在于细胞表面，TLR4可识别大肠杆菌的内毒素——脂多糖(LPS)，髓样分化因子88(MyD88)与TLR4的结合导致IL-1受体相关激酶1/4(IRAK1/4)的招募和磷酸化，从而促进肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)的寡聚和自身泛素化[13]，进一步通过转化生长因子激活酶1(TAK1)激活IKK，最终导致NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)等转录因子的启动，从而诱导免疫和炎症反应。Wang等[14]研究发现，富含多酚的蜂胶提取物通过干扰TRAF-6依赖的多泛素链形成及其泛素化缓解LPS诱导的炎症过程，降低了RAW 264.7巨噬细胞中IL-6、单核细胞趋化蛋白-1和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生。Zhang等[15]研究表明，水甘草碱通过遏制TRAF6泛素化降低LPS诱导的小鼠巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。同时，Yao等[16]研究发现，LPS刺激诱导激活TAK1和蛋白激酶B(AKT)，导致iNOS、环氧合酶-2(COX-2)和多种促炎因子的高表达，而蒲公英醇通过降低TAK1的多泛素化抑制了RAW 264.7细胞中NF-κB的活化。

TLR2能够识别革兰氏阳性菌的肽聚糖[17]，如金黄色葡萄球菌和无乳链球菌等[18]。金黄色葡萄球菌会造成奶牛患临床型乳腺炎，但它也会导致奶牛出现无明显肉眼可见临床症状且难以治疗的乳腺内感染[19]。Ge等[20]研究发现，蒲公英可以通过TLR2-NF-κB/丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径抵抗炎症，防治金黄色葡萄球菌的感染。且在这一通路中，蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果表明NF-κB相关蛋白的磷酸化受到了抑制。因为底物蛋白的磷酸化是该蛋白经泛素蛋白酶体途径降解的基础[21-22]，所以蒲公英在发挥抗炎过程中同样抑制了NF-κB通路关键蛋白的泛素化。Guo等[23]研究显示，木犀草素能够阻碍小鼠乳腺上皮细胞中IκB-α和NF-κB p65的磷酸化程度以及基质金属蛋白酶的表达，这些发现表明木犀草素是减少金黄色葡萄球菌型奶牛乳腺炎组织损伤的潜在疗法。无乳链球菌是造成奶牛隐型乳腺炎的主要病原体之一[24]，且患病奶牛自愈率不高。孙铭维等[25]利用Western blot技术检测了壳聚糖对无乳链球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞中NF-κB和MAPK通路相关蛋白磷酸化的影响。研究表明，壳聚糖抑制了NF-κB p65的磷酸化，即阻碍了NF-κB二聚体的核移位[26]。同时，p38 MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化程度显著下降，有效减少了炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8的表达。因此，在病原体诱导的NF-κB激活中，可通过调节TRAF-6、TAK1和IκB-α等关键蛋白的泛素化调控机体炎症通路的活化水平，防止炎性因子的过度产生，使得机体免疫系统维持在健康状态。

1.2 炎性因子激活NF-κB中的泛素化调节作用

IL-1和TNF-α是诱导NF-κB活化的常见细胞因子[27]。对于过量炎性因子导致的细胞炎症中，IL-1刺激细胞上的IL-1受体，导致TRAF-6的激活，该酶催化K63多泛素链的合成，靶向激活TAK1激酶。IKK继而被激活，IκB-α发生磷酸化和泛素化降解，引起NF-κB的激活[14, 28]。在TNF-α途径中，TNF-α招募多种E3泛素连接酶到TNF受体，包括TRAF2/5和细胞凋亡抑制蛋白CIAP1/2等[29]。这些E3泛素连接酶与E2泛素结合酶催化K63、K11和线性化多聚泛素链的形成，招募TAK1和TAK1结合蛋白(TAB)，最终引起NF-κB的激活[30]。高玲等[31]利用IL-1β和TNF-α对大鼠皮层的神经细胞进行处理，Western blot结果表明二者均可诱导NF-κB的激活。Windheim等[32]研究表明，IL-1诱导IRAK1的K63连接的多聚泛素化，促进NEMO的结合和IKK的激活。Zhang等[33]用生物素标记的TNF-α和磁珠进行免疫共沉淀，并用Western blot技术检测了RIP1对TNF受体的募集和泛素化，结果表明TRAF-2环状结构域在TNF-α诱导的RIP1泛素化过程中起重要作用，但是TRAF-2介导的RIP1泛素化在TNF-α诱导的NF-κB活化中没有实质性作用。

1.3 自由基激活NF-κB中的泛素化调节作用

动物机体在受到各种氧化应激时，如分娩、高温、饲粮成分的改变等，体内氧化与抗氧化系统稳态失调，机体自由基产生过多，造成炎性细胞浸润、组织损伤等现象[34]。K63连接的多泛素化是一种氧化应激调节因子[35]。Silva等[35]利用氨基酸稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术对过氧化氢(H2O2)处理的酵母菌株进行蛋白组分析，结果表明K63连接的多泛素化在细胞中立即增加，使细胞对应激更加敏感。同时，外源H2O2会影响IκB-α酪氨酸残基的磷酸化，进而影响IκB-α的泛素化和降解以及NF-κB途径的激活[36]。此外，活性氧(ROS)还能通过失活泛素结合酶12(Ubc12)干扰IκB-α泛素化降解，进而启动NF-κB的活化[37]。

为了对抗氧化应激，细胞需要感知ROS水平并保护机体免受自由基损伤。为此，细胞诱导一系列基因的协调转录。核转录因子E2相关因子2(Nrf2)在诱导抗氧化应激基因表达中起着中心作用，如诱导NADPH醌氧化还原酶1(NQO1)和血红素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化分子的表达[38]。Kelch样ECH相关蛋白(Keap1)是调节Nrf2活性所必需的细胞质蛋白。在非应激条件下，Nrf2不断被E3连接酶复合物Cul3-Keap1泛素化，并在蛋白酶体中迅速降解；当细胞被自由基刺激时，Keap1的半胱氨酸残基被修饰，导致E3泛素连接酶活性下降，然后细胞核中的Nrf2积聚，由抗氧化反应元件(ARE)激活抗氧化酶基因的转录[39]。Shin等[40]用姜黄素处理小鼠表皮细胞(JB6 Cl41)，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot结果显示姜黄素诱导Nrf2蛋白表达而不改变其mRNA转录的稳态水平，这说明姜黄素能阻止Nrf2泛素化和后续的26S蛋白酶体降解，且质谱分析结果表明姜黄素的α，β-不饱和羰基部分可能是其与Keap1结合的靶点。同时，姜黄素通过Nrf2通路缓解H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激也已经得到了证实[38]。Chen等[41]利用ARE荧光素酶法检测了青蒿素处理的MDA-MB-231转染细胞，结果发现青蒿素以剂量依赖式诱导ARE依赖的荧光素酶活性增加，且Western blot结果表明青蒿素通过降低Nrf2泛素化的方式在蛋白质水平上稳定Nrf2。以上的研究表明，针对氧化应激通路中关键蛋白的泛素化调节自由基引起的炎症等疾病具有广阔的前景。

2 泛素化修饰对NLRP3炎性小体激活的调控

NLRP3炎症小体是先天免疫系统和调控炎症反应的关键成分，由炎症体传感分子NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸酶-1前体(pro-Caspase-1)组成[42]。NLRP3炎症小体的活化分为2个时期，首先在启动时期，TLR通过识别危险相关分子模式(DAMP)或病原体相关分子模式(PAMP)，激活NF-κB通路，导致炎症小体相关成分NLRP3和IL-1β前体(pro-IL-1β)基因的转录上调[43]；第2个时期是NLRP3的寡聚和组装，然后参与半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)激活和IL-1β及IL-18的成熟与渗出，从而引发炎症相关的细胞焦亡[44-45]。因此，抑制第1或第2阶段信号转导都能抑制炎症。Blonska等[46]研究表明，杨梅素能够抑制NF-κB的激活，显著降低IL-1β的mRNA水平。同时，杨梅素对NLRP3激活的第二信号通路也有抑制作用。Chen等[11]通过在脓毒症小鼠腹腔中注射杨梅素，利用Western blot技术分析了腹膜巨噬细胞中的泛素化水平，结果表明LPS的刺激能够促进NLRP3去泛素化进而激活NLRP3炎性小体，而杨梅素则通过促进NLRP3泛素化和减少ASC泛素化来阻断NLRP3炎症小体的组装，从而发挥抗炎作用。Zheng等[47]检测了脂质介质Maresin1对LPS诱导的野生型小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中NLRP3泛素化的影响，Western blot结果显示Maresin1通过促进K63连接的NLRP3多泛素化来阻碍炎性小体的激活。此外，NLRP3炎性小体激活也经常被报道与ROS相关，且通过第1时期NF-κB信号通路调控NLRP3炎症小体启动，许多抗氧化剂如褪黑素通过阻碍NLRP3炎性小体的激活来除去过多的ROS，并缓解炎症反应[48]。

3 小 结

炎症是一个复杂的过程，涉及到免疫系统中不同的信号通路，如NF-κB信号通路和NLRP3炎性小体的激活参与协调炎症反应，维持细胞稳态。炎症是一个动态的过程，当机体受到各种刺激时，炎症信号通路上的蛋白质受到多种翻译后修饰的调控，特别是泛素化修饰在通路蛋白发生降解中的动态调节作用。因此，了解泛素化修饰在NF-κB和NLRP3炎性小体激活中的作用及进展，可以为调控动物机体的炎症水平提供更多的理论依据，具有实际意义。