井冈山国家级自然保护区泥炭藓来源共生真菌多样性和抗菌活性研究

熊凤姣，刘文杰，丁 壮，唐佳慧，姜淑玲，郭文强

(1.井冈山大学 医学部，江西 吉安 343009；2.聊城大学 生物制药研究院，山东 聊城 252059)

0 引言

进入21世纪以来，耐药菌尤其多重耐药菌引起的感染性疾病己成为全球性公共卫生问题和严峻挑战。具有复杂耐药机制的金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌等耐药菌的出现给临床创伤治疗和细菌感染预防带来了巨大的挑战，这使得耐药性问题成为了临床上关注的焦点[1，2]。随着国内外抗生素的滥用和误用使得耐药细菌和耐药基因的快速出现，这极大地降低了抗生素对人和动物体内多种病原体的治疗潜力，严重地威胁着抗生素治疗的有效性和人类健康[3]。耐药细菌所致深度感染已构成新世纪抗感染治疗的新挑战，早在 2011 年世界卫生组织就已提出“控制细菌耐药的全球性策略”，将细菌耐药问题上升为全球性的危机[4]。细菌耐药性的迅速上升和新抗生素的不断减少形成了鲜明对比，大力研发以控制耐药菌感染为主要目标的新结构、新靶点和新机制的新抗生素，是当前医药界一个十分紧迫的任务[5,6]。然而，与耐药现状不相符的是新结构、新机制的抗菌药物研发却明显滞后，在后抗生素时代亟需挖掘新型抗生素类药物来应对日益严峻的耐药问题。

天然产物因其广泛的化学和生物学多样性，作为新型分子骨架的重要源泉，已成为潜在的药物先导化合物宝库[7-9]。随着微生物药学研究的日益深入，普通生境来源微生物资源出新率越来越低，新生境资源的发现迫在眉睫。基于现有的研究方法，从普通生境的微生物资源中已经很难获得突创性的天然产物，药学研究的焦点逐渐转向深海、高原、自然保护区等具有地域特色的特殊生态环境，其已成为新微生物物种和新抗生素类先导化合物的资源库[10,11]。井冈山国家自然保护区作为一个极具南方红壤丘陵特色、又兼顾森林地貌的生态环境，其中孕育着丰富的生物群落[12]。井冈山地区属于亚热带湿润山地气候，由于常年降水量丰富，在岩壁上形成了大片极具地域特色的泥炭藓群落。而且泥炭藓细胞壁上有加厚螺纹和多孔结构，又具有很强的吸水能力；同时泥炭藓自身含有泥炭藓酸、黄酮、甾醇等多种具有较好的抑菌作用代谢产物[13]。由于岩壁泥炭藓所形成的特殊“微”生态环境，预示着其中共生的微生物可能具有独特的生物合成代谢途径，能够产生结构类型新颖的药物先导化合物。

本研究聚焦特殊生境真菌的独特资源优势，对泥炭藓来源共生真菌进行了多样性和抗菌活性研究，在初步构建井冈山地区微生物资源库的同时，也为寻找具有潜在抗菌活性的共生真菌提供研究策略的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品。岩壁泥炭藓样品(Sphagnum palustre L.)于2018年3月份采集于江西井冈山地区(罗霄山脉中段，N 26°29′25′′，E 114°7′13′′)。

1.1.2 培养基。固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

液体发酵培养基(真菌2号)：葡萄糖(10 g/L)，麦芽糖(20 g/L)，味精(10 g/L)，甘露糖醇(20 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，玉米浆(1 g/L)，酵母浸粉(3 g/L)，MgSO4·7H2O(0.3 g/L)和蒸馏水1L，调节pH为6.5。

1.1.3 实验仪器。微生物操作采用超净工作台SW-CJ-2D(苏州苏洁净化设备有限公司)；无菌化处理采用高压灭菌仪KXQ-LS(上海博讯有限公司)；微生物培养采用电热恒温培养箱DNP-9082P03Ⅳ(上海新苗医疗器械制造有限公司)；浓缩采用旋转蒸发器RE-2000A(郑州科泰实验设备有限公司)、低温冷却液循环泵DLSK-5/20 (郑州科泰实验设备有限公司)、循环水式多用真空泵SHK-Ⅲ(郑州科泰实验设备有限公司)；微生物菌体破碎采用超声波清洗器KQ-300E；菌种保藏采用超低温冰箱U410；称量采用电子天平BSA-124SNMR。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌分离纯化。泥炭藓样品经过75%酒精浸泡处理1 min后，充分研碎置于中马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)于28 ℃孵育3-5 D，利用扩散板法进行菌株的分离纯化。从中分离出具有不同形态的真菌菌落，将其重新接种到新的PDA培养基，并在28 ℃下再孵育培养36 h。重复该划线过程多次，直到获得单菌落。根据菌落在PDA培养基上的外观(颜色、质地、边界类型和径向生长速率等)，将其分为不同的形态类型，最终得到共生真菌纯菌株。

1.2.2 共生真菌种属鉴定。按照已报道的实验方法从该来源的共生真菌中提取DNA， PCR反应采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增内部转录的间隔区(ITS)[14-16]。PCR产物由睿博生物科技有限公司(中国，北京)纯化和测序。通过BLAST分析将鉴定出的序列与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的其他序列进行比较分析，并在ClustalW中进行比对[17]。利用Godinho提出的标准来分析验证GenBank数据库的BLAST结果：对于查询覆盖率和序列同一性≥98%，该物种种属可以被确定；对于覆盖率和序列同一性在95%-97%之间的可以确定到种，而对于覆盖率和序列同一性≤95%，则可以认为是新菌[18]。系统进化分析则是采用MEGA X进行的，N-J法被用来估计种属进化距离，其自举值是根据1000次重复计算而得出的结果[19-20]。

1.2.3 共生真菌发酵培养与处理。菌株在含有100 mL真菌2号液体培养基的500 mL三角瓶中28 ℃静置发酵培养30 D。发酵完成后将发酵混合物用等体积的乙酸乙酯超声萃取2次。所得萃取液采用减压蒸馏获得粗提物后，甲醇重新溶解并用微孔滤膜过滤除去不溶固体杂质。挥干溶剂后称重，并配成5 mg/mL的澄清甲醇溶液，低温冷藏备用。

1.2.4 指纹图谱分析。真菌粗提物在HPLC系统(Waters Co.)中分析，该系统包含996型二极管阵列紫外检测器和ODS-C18色谱柱(YMC，4.6 mm×250 mm，5 μm)。40 min内从5%-100%甲醇梯度洗脱，并在100%的甲醇条件下继续洗脱10 min。

1.2.5 抗菌活性测试。以大肠杆菌、耻垢杆菌、金黄色葡萄球菌、草分支杆菌、枯草杆菌作为抗菌活性指示菌，利用纸片扩散法进行共生真菌粗提物抗菌活性筛选与评价，发现33株真菌粗提物具有较好的抗菌活性。氯霉素(0.1 μg/μL)被用作抗菌活性测定的的阳性对照。将纸片(直径10 mm)充分吸收菌株甲醇粗提液后挥干，并放置在鉴定菌琼脂表面上。于37 ℃下孵育24 h后，测量五种鉴定菌下纸片的生长抑制区直径。

2 实验结果与讨论

2.1 井冈山泥炭藓来源共生真菌种属分析

对该来源的123株共生真菌进行序列分析发现，其中包含了子囊菌类和接合菌类两大真菌类群。依据Godinho的分类标准，对提交到GenBank数据库的序列与相似菌株进行覆盖率和相似度的比对。从结果可知，大部分菌株与其最接近的种属展示了较高的相似度，初步可以确定该来源共生真菌归于16个属，即：Aspergillus,Penicillium,Trichoderma,Umbelopsis,Mortierella,Sordariomycetes,Colletotrichum,Mucor,Backusella,Talaromyces,Mortierella,Fusarium,Ascomycota,Epicoccum,Alternaria,Cochliobolus；分属46个目，即：onobense,pulvillorum,ochrochloron,simplicissimum,skrjabinii,glabrum,citrinum,aureoviride,odoratum,radulatum,lividum,herquei,oxalicum,rolfsii,isabelline,kananaskense,minutissima,gloeosporioides,circinelloides,abundans,tuberculispora,uredinicola,niger,tenuissimum,ramanniana,asperellum,purpureogenus,amestolkiae,chrysogenum,parasiticus,harzianum,versicolor,hamatum,halotolerans,vinacea,parvispora,tricinctum,sorghinum,perangustum,tenuissima,cladosporioides,spinulosum,gloeosporioides,isabelline以及kusanoi(表1)。

续表1 由ITS序列鉴定的共生真菌的化学特征

续表1 由ITS序列鉴定的共生真菌的化学特征

将所有共生菌株的ITS序列输入MEGA X进化分析，并通过构建系统发生树来对井冈山地区泥炭藓共生真菌的亲缘性进行研究(图1)。该序列分析涉及123个核苷酸序列，包括的密码子位置是1st+2nd+3rd+Noncoding。最优树的分支长度总和为4.14882389。分支旁边显示了在引导测试中关联的分类单元聚集在一起的复制树的百分比(1000个重复)[21]。该树是按比例绘制，其分支长度与用于推断系统发育树的进化距离的单位相同。进化距离使用Kimura2-parameter法计算而得来的，单位是每个位点的碱基取代数[20]。对于每个序列对，删除所有歧义位置，最终数据集中共有754个位置。

2.2 井冈山泥炭藓来源共生真菌抗菌活性

将所有菌株采用真菌2号培养基静置发酵30 D后，获得123个代谢粗提物。在对其进行五种鉴定菌的抗菌活性筛选后发现33株共生真菌的次级代谢产物表现出抗菌活性，其中PenicilliumonobenseJW-13-1、PenicilliumpulvillorumJW-13-16、PenicilliumskrjabiniiJW-13-22表现出广谱的抗菌活性，同时PenicilliumoxalicumJW-13-91的代谢产物则针对金黄色葡萄球菌显示出了独特的抑制活性(表2)。

表2 井冈山地区泥炭藓共生真菌次级代谢产物抗菌活性

R=13-18 mm为中等活性，R=10-13 mm为低/无活性；氯霉素作为抗菌活性筛选的阳性对照药。

2.3 活性菌株代谢产物分析与分离纯化

通过对所有共生真菌的次级代谢产物进行HPLC-UV分析后发现，其有多个菌株的代谢产物具有特征的指纹图谱(图2)。其中菌株Penicilliumsp.JW-13-9、PenicilliumochrochloronJW-13-35、CladosporiumuredinicolaJW-13-61、PenicilliumspinulosumJW-13-80、PenicilliumchrysogenumJW-13-96、Penicilliumsp.JW-13-107的指纹图谱中表现出了系列的紫外吸收，预示着这些共生真菌的次级代谢产物具有系列的天然产物。

图2 部分菌株次级代谢产物的HPLC-UV指纹图谱

3 结论

本研究聚焦井冈山自然保护区岩壁泥炭藓自身所处的特殊生态微环境，深入挖掘其中共生的微生物的物种多样性和抗菌活性。该来源共生真菌因生存环境的特殊性造就可能具有异于普通生境下真菌的生物合成代谢途径，预示着其极具代谢潜能和研究价值。

通过对其中微生物进行分离纯化发现，泥炭藓共生真菌的种属覆盖面较广，但其中存在较多的仍为青霉属真菌，占到总分离真菌的58.5%，其他类种属共生真菌占比较小。结合菌株次级代谢产物的抗菌活性筛选，我们发现泥炭藓的共生真菌次级代谢产物具有较好的抗菌活性，活性率达到26.8%。并且发现3株共生真菌的代谢产物具有广谱的抗菌活性，多株真菌具有较为独特的抗菌谱，同时，HPLC-UV指纹图谱分析也发现多株共生真菌具有特征的系列紫外吸收，这为后期活性天然产物的挖掘研究提供了菌株基础。本研究的开展对特殊地区抗耐药菌抗生素类先导化合物发现及我国创新药物的研发具有重要的意义。