口服酵母载体疫苗在畜禽疫病防控中的应用

迟 恒，黄金海

(天津大学生命科学学院，天津 300072)

科学技术的发展大大推进了公共卫生及其服务的改善，但传染性疾病依然对人类和动物健康造成极大威胁与挑战，而疫苗则是预防和控制传染性疾病最有效的手段之一[1]，疫苗接种是预防和控制传染性疾病最为可行，最具经济效益的策略。疫苗不仅在人类传染性疾病防控中发挥着重要的作用，也可以有效保护动物免于病毒的侵害，为畜牧业安全生产提供了有效保障[2]。

传统常规疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗，但这些疫苗有可能导致接种者产生过敏反应，特别是减毒活疫苗有毒力残留，存在毒力返强、体内重组的风险。随着科技的发展，病毒活载体疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、酵母疫苗等新型生物技术疫苗的理论及实践应用得以拓展。其中酵母疫苗具有免疫途径简单，安全性高、生产成本低等优势，在水产、兽用领域对酵母表达系统在疫苗领域的开发及应用展现出广阔前景[3]。本文就全重组酵母(whole recombinant yeast,WRY)疫苗以及酵母表面展示(yeast surface display,YSD)系统等新型酵母疫苗模型及其口服疫苗的应用做一综述。

1 口服酵母载体疫苗

酵母表达系统是表达具有疫苗学意义蛋白质的重要模型，虽然目前已经发现700多种酵母，但考虑到安全性与稳定性，仅有酿酒酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母以及解脂耶氏酵母等少数几种酵母可作为生产疫苗的工程菌株，其中酿酒酵母和毕赤酵母是使用最为广泛的疫苗菌株。酿酒酵母在人类酿酒业已经使用了上千年，不仅易于培养，工艺简单，具有较高的安全性。真核生物酵母表达的外源基因可以进行翻译后修饰(如蛋白质糖基化修饰等)，具有良好的生物学活性与较高的稳定性。酵母表达系统可以安全、快速、经济的表达病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白等，且不影响蛋白质的免疫原性，是较为理想的疫苗表达系统。

口服酵母载体疫苗主要包括全重组酵母疫苗以及酵母表面展示疫苗两种。酿酒酵母具有食品级的安全性保障，酵母细胞壁含有的β-葡聚糖是机体免疫应答过程重要刺激剂和调节剂[4]，可作为天然佐剂使用。表达在酵母胞浆内，或通过不同细胞壁锚定序列融合外源病毒蛋白并展示表达与酵母细胞外获得的完整酵母可作为全重组酵母疫苗使用[5]。酵母细胞可以作为一种生产系统或分泌递送系统，提供简单、分泌表达的亚单位疫苗生产平台，简化昂贵的下游蛋白质纯化步骤。

酵母表面展示技术最开始应用于食品的加工过程，后来被广泛应用于展示病原体特异性抗原从而制备相应疫苗的研发。酵母表面展示疫苗的原理是将目的抗原与酵母中的细胞壁蛋白(Cwp1p、Cwp2p、Gas1p、Aga1p、Aga2p、Flo1p、Tip1p)融合表达，并在细胞壁蛋白的协助下将目的抗原锚定在细胞表面[6]。其中，最常见的酵母展示系统采用目标蛋白与具有锚定作用的Aga1p亚基与黏附作用的Aga2p亚基融合，锚定在酵母细胞表面的Aga1p亚基通过Cys7和Cys50残基与Aga2p亚基形成两个稳定的二硫键，实现融合蛋白在细胞表面的锚定。与全重组酵母疫苗类似，酵母表面展示疫苗也可以作为口服疫苗，促进机体的黏膜和体液免疫反应。

2 口服酵母载体疫苗的免疫机理

2.1 酵母细胞壁葡聚糖是天然的免疫佐剂

酵母细胞壁中含有β-1,3-葡聚糖以及β-1,6-葡聚糖，二者均是免疫应答的重要刺激剂和调节剂。β-葡聚糖颗粒偶联蛋白可被树突状细胞加工成短肽，并通过MHC分子呈递给T细胞，进而导致抗原特异性Th1和Th17细胞被活化。此外，β-葡聚糖还可以激活细胞内信号转导途径，增加细胞内水解和代谢酶的含量和活性，导致吞噬细胞活化，促进白介素IL-1、IL-9和TNF-α等炎症因子的产生[7]。研究表明，酵母细胞壁中的葡聚糖可诱导原代巨噬细胞中细胞因子以及核转录因子κB(NF-κB)的产生，可通过PI3K途径激活并增强T淋巴细胞反应，从而调节机体的免疫反应。酿酒酵母细胞壁被证明可有效激发绵羊肠道上皮细胞TLR2-MyD88-NFB通路，并诱导-防御素的产生，提高绵羊先天性免疫能力[8]。大量体内试验表明，在动物日粮中添加酵母细胞壁可以促进动物生长，降低氧化应激反应，调节细菌平衡和营养物质转运，抑制炎症反应，并促进免疫球蛋白的产生[9-11]，临床试验已证明口服酵母β-葡聚糖对免疫系统具有积极作用。

2.2 口服酵母载体疫苗可有效激发机体黏膜免疫

传统疫苗主要通过激发机体的体液免疫系统发挥功效，而口服酵母载体疫苗则主要通过激发机体黏膜免疫来发挥功效。口服酵母载体疫苗可通过肠道黏膜上皮上的微皱褶细胞(microfold cell，M细胞)的吞噬转运效应摄入颗粒性抗原，进入肠道黏膜组织中的重组酵母细胞可经DC细胞吞噬，完成抗原的加工、递呈，进一步激活淋巴组织的特异性T、B细胞活化，促进IgA类抗体的分泌，促进宿主黏膜屏障功能；摄入的酵母细胞可通过刺激黏膜下peyer's结中NKT、参与先天性免疫应答的ILCs等淋巴细胞亚群来调节免疫应答；还可以增强主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的表达，与树突状细胞和抗原提呈细胞表面分子产生共刺激作用，进而有效激活T淋巴细胞所介导的细胞免疫[12]。

2.3 调整肠道微生物菌群及生境，影响肠道黏膜下组织免疫细胞亚群

肠道微生物不仅具有协助宿主膳食纤维、制造维生素等生物学功能，还可以刺激黏膜免疫系统，增强宿主的免疫应答，肠道微生态菌群的平衡与稳态对宿主肠道免疫功能有着重要的影响[13]。肠道益生菌不仅可以诱导肠上皮细胞分泌蛋白，可以协助组织修复，还可以诱导Toll样受体(TLR)蛋白过表达，增强机体的免疫应答。肠道益生菌可以诱导IL-10细胞因子家族的表达，其中包括由树突状细胞产生具有抑制促炎反应的IL-10，以及由第3组固有淋巴细胞产生的具有增强细菌定植作用的IL-22，进而激发机体产生免疫应答，提高宿主的抗病毒感染能力[14]。

口服酵母疫苗对肠道微生态菌群、黏膜组织内免疫微环境、Th17/Treg细胞亚群细胞的平衡、细胞因子谱等的调节作用也影响着机体的免疫力及抗病状态。酵母可以调节肠道内微生物菌群的平衡，进而影响机体的肠道免疫功能。通过小鼠结肠炎的葡聚糖硫酸钠(DSS)模型，证明益生菌酿酒酵母不仅可以有效改善DSS引起的结肠损伤，而且增加了肠道细菌的多样性，进而改善了DSS结肠炎引起的营养不良状况[15]。酿酒酵母还可改变组织细胞中miRNA表达来调节免疫应答，发挥抗小鼠结肠炎的作用。益生菌酵母还可以对肠道感染有关的疾病起良好的调节作用[16]，颉颃肠道致病微生物的作用毒力因子，如毒素，脂多糖等，发挥抗炎症反应。口服酵母还可以有益地调节动物的肠道中谷胱甘肽代谢途径以及蛋白水解酶活性，促进动物生长，提升宿主的免疫力。热灭活酵母和活酵母均可以有效激活特异性免疫反应，并引起同等的保护性免疫，从而避免了活疫苗致病性的风险。口服酵母载体疫苗已经证明可以激发猪、禽类、小鼠、兔、人等多宿主的特异性抗体反应及细胞、黏膜免疫反应，具有广阔的应用前景。

3 口服酵母载体疫苗的应用

相较于传统疫苗，口服酵母载体疫苗具有以下显著优势：①酿酒酵母遗传背景清晰，遗传改造操作方便，生产工艺简便，生产成本较低，不产生毒素，具有较高的安全性。②与原核表达系统相比，酵母表达系统可以对抗原蛋白进行糖基化等翻译后修饰，有利于保持生物产品的活性和稳定性，通过分子生物学技术进一步改变酵母糖基化途径，构建哺乳动物源化的酵母底盘细胞，使其更接近于人以及其他动物宿主细胞的糖基化模式，使得外源病毒蛋白的表达更接近于天然病毒蛋白更有效的激发机体免疫[19]。③口服疫苗使用方便，避免传统疫苗繁琐的纯化过程以及过高注射成本、传播血源性病原体的风险的问题。传统多肽疫苗稳定性较差，对储存，运输有特殊要求：从生产到接种前都要保存在2℃～8℃条件下，在一些资源匮乏的发展中国家难以实现这样的运输与保存条件。生化试验结果表明，在2℃～8℃和23℃～25℃下储存时，酵母细胞能够在1年内保持抗原稳定，可以解决蛋白质抗原稳定性的难题。

口服酵母载体疫苗越来越被科研人员所重视，在畜牧水产业中的优势突显。研究人员以酿酒酵母作为宿主，红点石斑鱼坏死病毒(RGNNV)的重组衣壳蛋白当作模型抗原，经研究发现与免疫纯化重组衣壳蛋白的小鼠相比，免疫全重组酵母疫苗的小鼠产生的IgG抗体滴度提高了9倍～27倍[20]，证明全重组酵母可作为口服疫苗使用且有良好的免疫原性。还可利用酵母系统表达对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的VP19和VP28蛋白，将全重组酵母疫苗与食物混合喂养小龙虾25 d。喂养全重组酵母疫苗的小龙虾存活率显著高于对照组[21]，证明了该疫苗的有效性。

通过酵母表面展示系统表达高致病性禽流感H5N1的血凝素蛋白(HA)，可以激发接种疫苗小鼠的体液免疫与细胞免疫，对小鼠无明显副作用，提供了一种制备流感疫苗的备选方法。酵母表面展示系统的登革病毒(DENV)口服酵母疫苗，在酿酒酵母表面表达登革病毒包膜域Ⅲ蛋白(scEDⅢ)，小鼠口服该疫苗后其体液免疫反应以及黏膜免疫反应显著上调，可激发小鼠IgG及IgA抗体产生并有效的中和抗体，表现出该疫苗作为针对登革病毒感染的有效口服疫苗的良好前景[22]。将人肠道病毒71(EV-A71)的衣壳蛋白展示在酿酒酵母的表面上，可以有效诱导免疫后小鼠发生体液和黏膜免疫反应及脾脏Th1免疫反应，并且在母鼠进行口服免疫后可以有效保护致死性EV-A71引起的新生鼠感染，提供了一种抗人肠道病毒71感染的潜在的口服疫苗[23]。表1是近几年研发的酵母表达系统制备的病毒疫苗，虽然各疫苗所处阶段不同，有的尚在实验室阶段，有的已经被批准进入临床试验阶段，但随着对酵母系统研究的不断深入，一定会有越来越多的酵母疫苗投入使用。

表1 酵母表达系统制备的疫苗

4 展望

口服酵母疫苗在理论基础及技术应用上尚有许多问题需要进一步明确：①对酵母载体疫苗激发免疫调节的机制的理论研究还在初级阶段，对其激活先天性免疫细胞的亚群、调节免疫微环境的分子细节等研究仍不充分；②工程化的酵母在高密度发酵过程中的生物量、外源蛋白表达动力学及稳定性问题；③口服酵母疫苗在不同动物物种、疫苗类型效果的差异性研究；④酵母口服疫苗和传统疫苗的协同效应；⑤肠胃环境会对抗原产生部分口服酵母产生降解破坏，酵母口服耐受性等问题，都需要进一步的加强研究。酵母疫苗在安全性、免疫方式、生产及人工成本等方面有显著优势，酵母细胞独特的的肠道菌群扰动效应、细胞壁β-葡聚糖的免疫佐剂效应，预示着全重组酵母疫苗以及酵母表面展示疫苗直接口服免疫会逐渐被接受。口服酵母载体疫苗在动物疫病防控中会展现出更为广阔的应用前景。