艾滋病疫苗研究面临的挑战和进展*

张 乔，陈国兵，牛海涛，罗钧洪，梁晓峰，高 峰△

（暨南大学1分子医学病毒研究所，2基础医学与公共卫生学院微生物与免疫学系老年免疫学研究所，3实验动物管理中心，4基础医学与公共卫生学院系统生物医学系，5基础医学与公共卫生学院公共卫生与预防医学系，广东广州510632）

艾 滋 病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人免疫缺陷病毒（human immunodeficien‐cy virus，HIV）攻击机体免疫系统所引发的一类传染性疾病。HIV-1通过特异性感染CD4+T淋巴细胞进而摧毁机体的免疫功能，最终诱导多种并发症的出现，例如结核、肺炎、细菌感染以及血液系统肿瘤等［1］。最新WHO统计数据显示，截止2019底，全球约有3 800万HIV-1感染者，其中包括180万儿童；2019年新发感染者170万，死于艾滋导致的并发症人数达到69万人［2］。更为严峻的是，联合国艾滋病规划署制定的2020年90/90/90目标（90%HIV-1感染者得到确诊，90%确诊病人得到治疗，90%治疗病人的病毒血症得到控制）也宣告失败，预示攻克艾滋病仍任重道远。

尽管与艾滋病大流行的斗争即将迈入第40个年头，但是目前人类仍无法完全治愈艾滋病。在抗HIV病毒药物领域，科学家们取得了巨大成就，抗逆转录病毒鸡尾酒疗法（combination antiretroviral ther‐apy，cART）的出现成功将艾滋病转变为一种长期可控性疾病，显著提高了患者的生存率［3］。然而患者需终身服药所伴随一系列的副作用如神经性病变、胰腺炎或骨质疏松等显著影响了患者生活质量和寿命［4-6］。此外，经济发展不平衡也增加了艾滋病治疗的困难。在重灾区南非，死于艾滋病的人数占全国总死亡人数的28%，而欧洲则低于0.1%［7］。面对艾滋病大流行，国际已形成广泛共识：有效的预防性艾滋病疫苗是终结艾滋病流行的最有效手段。

2009年，艾滋病疫苗III期临床试验（RV144）结果显示该疫苗具有一定程度的预防效果，这是科学家第一次在临床试验中发现可检测到的保护效果［8］。尽管保护效率只有31%，但是也给艾滋病疫苗研究领域带来了鼓舞和希望。然而遗憾的是，研究人员最近在南非开展的III期临床重复试验（HVTN 702）数据显示，相较于对照组，疫苗接种组没有保护效果［9］。尽管前期的I、II期临床试验结果显示疫苗诱导了细胞和体液免疫反应，但是III期试验失败提示疫苗诱导广谱中和抗体（broadly neutralizing anti‐body，bnAb）的重要性。多次III期临床试验的相继失败促使疫苗学家逐步加强疫苗与免疫学的理论研究并在研究bnAb以及抗体进化机制中取得了重大进展。bnAb能有效中和多种异源性HIV-1毒株，具有高效的抗病毒效果，目前诱导bnAb已成为下一代HIV-1疫苗设计的核心问题。但是，现阶段在所有实验动物和人类中尚没有任何一种疫苗能够成功诱导针对难以中和的多种异源性HIV-1 tier-2毒株的bnAb。因此，通过免疫原来诱导bnAb已成为目前艾滋病疫苗研发的核心科学问题与挑战。本文总结了现今HIV-1疫苗研究面临的困境以及新的研究进展，期望为HIV疫苗的后续研究提供新的思路。

1 缺乏理想的动物模型

临床前动物模型评价是疫苗研究重要环节之一。目前，HIV-1病毒无法在动物内复制，导致HIV-1候选疫苗缺乏理想的动物评价模型。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）在感染、传播和潜伏期方面与HIV-1病毒非常相似，通过将HIV-1膜蛋白基因（env）取代SIV基因组中的相应env，研究人员成功建立了嵌合病毒（simian/human immunodeficiency virus，SHIV）感染非人灵长类（nonhuman primates，NHP）动物模型。SHIV感染模型在HIV-1疫苗保护评价、诱导bnAb及其进化研究中得到了广泛应用。然而，SHIV感染方式、剂量以及时间参数都可显著影响疫苗评价结果［10］。

HIV-1在自然传播过程中主要通过性接触暴露黏膜表面进而发生感染。但由于血液中存在大量具有感染性的病毒颗粒，经血传播具有更高的传染性。目前，临床前动物评价主要采用黏膜和静脉注射方式，而前者应用更加广泛。单次高剂量（single highdose，SHD）感染在研究早期得到了广泛应用，但是其存在明显缺陷。尽管SHD能达到接近100%感染率，但是过高的病毒滴度减弱了疫苗诱导的免疫保护作用，进而显著低估候选疫苗的保护效价［11-12］。另外，SHD与HIV-1正常感染过程也相差甚远。正常情况下，性接触导致的HIV-1感染率较低，阳性男性患者精液的病毒平均数约为每毫升11 000个拷贝，而在动物模型中，即使低剂量病毒（TCID50小于250），其每毫升拷贝数也超过1百万，远远大于正常感染过程中的病毒滴度［13-14］。因此SHD不能很好地模拟HIV-1病毒正常传播过程。低剂量重复（re‐peated low-dose，RLD）感染由于能较好模拟HIV-1病毒自然感染过程已经成为临床前动物评价的标准方法。RLD通过低剂量重复感染使未免疫对照组所有或大部分猴建立感染，可更好地再现人类HIV-1粘膜感染的过程与特征。因而在有限的动物数量情况下，RLD模型能较敏感地评价疫苗的保护效果。模拟研究显示，RLD模型只需要50只猴（每组25只）就可以达到足够的统计能力检测到候选疫苗的50%保护效果，这大大增加后续临床试验成功的可能性［15］。

病毒感染滴度和频率是影响RLD模型评价的关键因素。不同研究团队使用的病毒感染滴度存在很大偏差，有效TCID50值可能相差10倍以上，可能的解释是不同的传代次数和体外扩增方法影响了病毒的感染力［14，16］。因此，在试验前确定准确的病毒感染滴度对试验成败至关重要。目前大部分研究采用每周一次的感染频率来建立感染模型，未免疫猴的初次感染率一般在20%～40%范围内，采用该感染方式可以较好地评价候选疫苗的保护效价。研究显示单剂量接种导致的SIV感染一般发生在5～14 d内［17］。如果采用两周一次的感染频率感染猴，分别在第6、10和14天检测动物的血清转化指标，结果显示74%的阳性转化发生在10 d之后［17］。这些实验结果表明每周1次的感染频率可能会过高估计免疫的保护作用，采用两周1次的感染频率以及更频繁的指标检测可取得更准确的评价效果。尽管RLD模型可较好地评价疫苗保护效果，但是仍存在一些限制性因素导致其评价效果很难在人类临床试验中完全再现：（1）模型采用的SHIV不能完全模拟HIV-1病毒感染过程；（2）不同SHIV毒株间的感染和致病能力差别很大，因此选用不同的SHIV毒株可对疫苗评价产生非常大的影响；（3）该模型的初次感染率仍显著高于HIV-1的自然感染率，接种采用的低剂量病毒滴度也远高于感染者阴道分泌物或精液中的病毒含量。然而，如果通过进一步减小病毒滴度来降低感染率的话，将会显著延长研究时间，大大增加研究费用。众多影响因素导致的不确定性迫使人们通过提高动物样本数来获得具有显著差异的统计能力，期望能更有效地评价疫苗的保护效果。

2 HIV-1包膜蛋白自身不足以诱导广谱中和抗体

HIV-1具有高度的基因序列多样性，导致其预防性疫苗必须具有广谱的免疫保护能力。在慢性HIV-1感染者中，约有10%左右的感染者会自然产生bnAb，通常在感染2～4年后才会出现，仅在儿童体内偶有感染1年内即产生bnAb的报道［18-19］。新的研究证据也表明，感染者体内的中和抗体需要经过长期的体细胞高频突变（somatic hypermutation，SHM）积累，才能获得广谱性和中和强度。分析进化过程中抗体序列显示抗体中和强度和广度与SHM的积累成正相关，表明长期的SHM积累对HIV-1中和抗体广谱性的获得是必要的［20-21］。由于HIV-1包膜蛋白（Env）固有的弱免疫原性以及抗体进化等限制性因素，现有免疫策略仍无法诱导针对HIV-1的bnAb的产生。

HIV-1的Env由gp120和gp41两部分构成，存在于病毒表面的包膜蛋白由3个单体通过非共价键形成三聚体结构；gp120位于包膜外侧主要负责结合细胞受体，而gp41负责将整个膜结构锚定在病毒膜表面，负责病毒和细胞融合。目前的Env三聚体免疫原尚无法有效诱导中和抗体反应，主要原因在于其固有的弱免疫原性无法诱导较高的抗体中和免疫反应。采用相同条件免疫HIV-1 gp120与狂犬病病毒G蛋白时，HIV-1 gp120诱导的IgG和IgA水平低于G蛋白［22］。对比乙肝表面抗原疫苗，尽管gp120在狒狒体内诱导了相似水平的抗体反应，但是其抗体浓度下降率明显快于乙肝抗原，原因可能是gp120诱导了较少数量的长效浆细胞［23］。以上数据表明，相较于其它病毒性抗原，gp120具有较弱的免疫原性从而无法诱导持续的抗体反应。随着结构生物学的发展，高分辨率Env空间结构的解析促进了HIV-1免疫原的结构优化。通过结构修饰，人们制备了更加稳定的类似天然Env的三聚体（例如SOSIP和UFO）［24-25］。冷冻电镜分析显示SOSIP.664具有和病毒颗粒Env高度类似的空间构象，目前已作为HIV-1免疫原设计的主要结构前体被广泛使用。由于提高了三聚体在体内的稳定性以及抗原表位展示，SOSIP.664具有更好的免疫原性。在多种动物如兔子、豚鼠以及猴模型中，SOSIP.664三聚体结构首次诱导了同源Tier 2病毒中和反应，但是对异源病毒的中和反应仍在很少的情况下被观察到［24，26-27］。

导致HIV-1 Env弱免疫原性的原因目前仍不清楚。大量证据显示Env的高度糖基化修饰是一个重要因素。对比来看，流感病毒血凝素单体大约含有3个聚糖分子，呼吸道合胞病毒融合蛋白有5～6个聚糖分子，而HIV-1 Env单体含有近30个聚糖分子，远远高于许多其它病原膜蛋白［28］。由于糖基不能有效地被机体免疫系统识别，具有免疫耐受性，因此高度糖基化的Env无法有效激活机体的免疫反应。中和抗体的进化成熟需要经过抗体基因高变区（V）的高频突变积累产生各种B细胞克隆，这个过程需要辅助性T细胞Th2激活体液免疫来实现。辅助性T细胞通过受体特异性识别抗原呈递细胞上的辅助性T细胞表位（Thelper cell epitope，THCE）从而促进Th1或Th2的激活，而位于抗原水解位点附近的聚糖分子通过形成空间位阻阻止蛋白酶的水解，影响抗原表位的释放，最终抑制体液免疫的激活［29-30］。细胞内广泛分布各种糖分子结合蛋白凝集素，研究发现甘露糖结合凝集素高亲和性结合SOSIP膜蛋白聚糖表位，减弱Env的免疫原性，抑制了中和抗体的产生［31］。

HIV-1膜蛋白分子gp120介导的免疫逃逸也影响Env免疫原性，gp120基因的高频突变可逃逸免疫压力。即便当氨基酸的改变不显著影响gp120的正常生理功能时，也可促进HIV-1对中和抗体产生逃逸［32］。机体通过激活天然免疫促进适应性免疫保护，疫苗佐剂的增强效应主要利用该过程来实现。浆细胞样树突状细胞胞内的TLR9受体识别寡聚脱氧核苷酸CpG，促进了I型干扰素和促炎症因子的表达，最终导致B细胞的活化。该过程中，gp120通过与树突状细胞表面的CD4以及甘露糖凝集素受体结合下调相关促炎症因子的表达，抑制B细胞的激活，可影响TLR9受体激动剂类佐剂在HIV-1疫苗中的应用［33］。值得注意的是，在免疫初期，疫苗注射位点的gp120局部浓度很高，与CD4受体相互作用的增强可能进一步加剧对B细胞活化的抑制。研究显示，抑制gp120与CD4受体的亲和力可提高DS-SOS‐IP.4mut抗原的免疫原性［34］。Gp120的W427S突变体可抑制gp120与CD4受体的结合，采用野生型和W427S突变体分别免疫小鼠后发现，野生型免疫原诱导了更高水平的非特异性辅助性滤泡T细胞、浆细胞以及血清IgG抗体，相较之下，突变体免疫原可诱导更高水平的特异性体液和细胞免疫反应［35］。

增强抗原免疫原性将有助于诱导更强的抗体反应。将破伤风疫苗的T细胞表位肽段整合到含有HIV-1 Env免疫原的类病毒颗粒中，免疫小鼠后发现，含有THCE的类病毒颗粒激活了更强的T细胞反应，显著提高了针对Env的IgG1抗体表达水平［36］。由于破伤风疫苗在人群中广泛接种，相应的记忆性T细胞可能会进一步加强该类病毒颗粒的免疫反应。利用纳米颗粒的多价结合也可有效提高抗原在体内的呈递效率，进而激活更强的B细胞反应，因此该材料在疫苗领域得到了广泛应用［37-39］。呼吸道合胞病毒的纳米抗原将中和抗体水平提高了10倍以上［37］。将不同流感病毒株来源的HA受体结合位点整合形成的马赛克疫苗，显著提高了抗体的中和广度［38］。但是，HIV-1 Env制备的纳米颗粒仅能将中和抗体滴度提高3倍左右，较其它病毒相差甚远，原因可能是Env聚糖分子的位阻效应和与凝集素的广泛结合［39］。疫苗佐剂可以显著增加疫苗的免疫原性，但是目前应用最广泛的铝佐剂可破坏HIV-1 Env的结构完整性，可能是其不能诱导bnAb的主要原因之一［40］。尽管如此，在SHIV感染猴模型中，一种新型的脂质体铝佐剂ALFA的保护效价达到90%，而铝佐剂对照组没有保护效果［41］。目前多种不同形式的铝佐剂和HIV-1疫苗组合正处于临床评价阶段，除此之外，突变型大肠杆菌耐热毒素、AS01b、ALF43等多种佐剂也处于临床评价阶段［42-43］。

免疫原缓释作为一种有吸引力的免疫方式在HIV疫苗研究中逐渐受到重视［44］。相较于传统的间断性免疫方式，它更接近于自然感染中的抗原提呈过程，可能引起更强的免疫反应，提高抗原的免疫原性。在小鼠体内，采用非机械性渗透泵持续缓释抗原两周，重复3次后检测发现，相较于少数间断注射，缓释免疫显著提高了辅助性滤泡T细胞TFH和生发中心B细胞的数量，而IgG抗体水平提高15倍［45］。同一研究小组进一步在猴模型中采用两种缓释模型验证了该免疫方式的增强效应［46］。与小鼠模型类似，抗原缓释显著增强了生发中心TFH和B细胞响应动力学，同源Tier 2病毒中和抗体水平提高20倍以上。更为重要的是，通过对Env特异性B细胞进行二代测序发现，缓释诱导了更多种类的Env特异性B细胞进而导致中和抗体的多样性。然而出乎意料的是，与对照组相比，二者的体细胞SHM相似。通过抗原示踪技术发现，缓释显著延长了抗原在淋巴系统的滞留时间，表明抗原的更多中和表位被有效呈递，提高了中和抗体的多样性［46］。

3 HIV-1包膜蛋白保守表位可促进广谱中和抗体的进化成熟

HIV-1病毒序列的多样性要求其疫苗具有广谱免疫保护能力。近年来，研究人员相继从感染者体内分离到许多bnAb并鉴定了与之作用的抗原保守表位，主要包括CD4结合区（CD4 binding site，CD4bs），V1V2，V3C3，gp41膜近端外膜区和gp120-gp41结合区［47］。利用HIV-1重组gp120抗原RSC3，通过单个B细胞分选，研究人员从HIV-1患者体内筛选出针对gp120 CD4bs的单抗VRC01，其广谱中和能力高达91%［48］。目前来看，靶向CD4bs的bnAb分离频率较高，原因可能是病毒需要充分暴露保守的CD4bs促进与靶细胞的结合，进而有效地递呈该表位，并诱导特异性bnAb的产生。比较来自于14名艾滋患者的16个CD4bs特异性bnAb发现，尽管这些抗体的碱基序列存在巨大差异，但是其空间结构基本相似［49］，这也解释了为什么它们都具有特异性识别CD4bs表位的能力。尽管它们之间具有高度的序列差异性，它们间的功能相似性表明它们通过不同的进化途径获得结合CD4bs表位的能力，最终能够广谱地中和大多数病毒株。

近来研究发现抗HIV-1 bnAb的产生需要一个长期进化成熟过程，生物信息学和单细胞测序技术的发展使得我们有机会探索它们的进化成熟过程。通过测序比较艾滋患者不同时期来源的血清B细胞发现，中和抗体广谱性的获得要求SHM的大量积累。当遭遇抗原后，B细胞通过SHM极大提高B细胞种类的多样性，理论上可以达到1012不同种类，而庞大的B细胞库保证了与TFH的有效识别和bnAb克隆筛选。CH103在2.5年时间内积累了17%的SHM从而获得了中和55%病毒的能力［20］，而CH235则在6年时间内积累了25.6%的SHM从而获得了中和90%病毒的能力［21］。由此可见，SHM的积累对bnAb的产生至关重要。

由于SHM的产生是随机事件，那么中和抗体是如何逐渐提高针对特定保守表位的中和能力呢？患者体内的HIV-1病毒通过不断突变来获得逃逸机体免疫压力的能力。事实上，从患者体内分离的bnAb并不能有效地中和患者体内当时存在的病毒，也不能降低患者体内的病毒滴度和缓解疾病进展，这表明bnAb的突变并不是以提高中和抗体的广谱性为目的［50］，但是病毒突变导致的多样性在促进中和抗体广谱性中起着重要作用［20，51，52］。有研究还显示，超级感染导致的病毒多样性与病毒重组可显著提高抗体的中和广度［53-54］。为了获得中和广度，中和抗体需要攻击Env结构上的保守表位，那些靶向其它非保守表位的抗体尽管可以不断进化，但是并不会获得广谱的中和能力，这也解释了为何从病人分离得到bnAb的概率偏低。不同时期的CH235抗体和Env共晶体结构显示，早期进化的CH235可以识别CD4的核心以及外围区域，但是随着抗体的不断进化，抗体识别膜蛋白上的表位逐渐缩小，最终进化的CH235仅主要识别高度保守的、所有HIV-1毒株共有的CD4bs而不再受CD4b s外围变异区域的影响，从而能够结合并中和大多数病毒，获得中和HIV-1的广谱性［21］。病毒通过删除V2区在第160位点聚糖修饰位点进一步暴露了CD4bs，从而促进CD4bs中和抗体的成熟［55］。另外，延长抗原在淋巴系统的滞留时间，促使抗原保守表位被更有效呈递，最终可增加中和抗体的多样性［46］。以上数据表明，抗原表位的充分暴露对bnAb产生至关重要。但是目前机体免疫系统如何“存档”已获得的表位信息，并进一步完善表位信息的分子机制仍有待进一步研究，例如存档信息是否提高TFH与特异性B细胞的结合。综上所述，尽管病毒突变与B细胞SHM属于随机事件，但是包膜蛋白上的高度保守表位仍然可在特定条件下诱导广谱中和抗体的进化成熟。

4 广谱中和抗体的进化机制及其在新型疫苗设计中的意义

尽管已从HIV-1感染者体内分离到许多bnAb，但是目前所有的免疫原在动物模型以及人体内尚不能诱导bnAb产生。为了探索诱导bnAb产生的进化过程，研究者通过单细胞和高通量测序方法获得bnAb成熟过程中产生的大量抗体基因序列，绘制抗体进化谱系，最终演绎bnAb的进化成熟过程。我们曾从一名非洲HIV-1 C亚型奠基病毒感染者（CH505）体内分离到CD4bs靶向的bnAb（CH103），通过中和抗体谱系分析，病毒进化分析和抗原-抗体共结晶等手段，首次描述了奠基病毒与bnAb共进化及其成熟过程，并在后续研究中进一步阐明了不同谱系B细胞之间的协同作用以及抗体从胚系到bnAb的成熟机制［20，21，52］。识别相同或其它表位bnAb的进化成熟机制也陆续得到阐释，证实并扩展了病毒与bnAb的共进化机制［51，56］。分泌HIV-1广谱中和抗体的B细胞在体内完成抗体基因重排并形成胚系共同进化祖先（unmutated common ancestor，UCA）后，需要在B细胞生发中心积累许多SHM来完成漫长的进化成熟过程。基于上述bnAb进化成熟机制的研究，目前提出了基于B细胞谱系的免疫原设计方案：首先从记忆B细胞中分离高效的bnAb；其次绘制其进化谱系推断胚系共同祖先和进化中间抗体（interme‐diate antibodies，IA）；最后根据UCA和不同IA与相应病毒包膜蛋白进化过程中的突变体的亲和力以及中和强度设计序贯免疫原，逐步诱导bnAb的产生。应用上述思路，研究人员在人源化小鼠体内成功诱导出可以中和tier-2毒株的bnAb［57］。如同自然感染，以序贯免疫方法有可能定向引导bnAb的进化成熟，缩短bnAb的产生时间。但是目前尚未在非人类灵长动物模型内得到验证。采用靶向胚系B细胞抗原设计也取得了重要进展，该方案主要目的是通过优化设计免疫原诱导目的bnAb前体B细胞的激活。VRC01类型bnAb特异性结合CD4bs靶点，但是这类bnAb的UCA抗体并不能结合异源病毒的Env，因此异源病毒的Env无法激活相应的胚系B细胞。通过蛋白互作设计、文库筛选与多靶点优化等手段，研究人员筛选得到优化的eOD-GT6免疫原。与野生型Env比较，eOD-GT6增加了8个突变位点。eOD-GT6与VRC01及其UCA和IA具有非常高的亲和力，这可能有助于相应B细胞SHM朝向成熟的VRC01发展。实验结果显示eOD-GT6纳米颗粒可成功激活表达VRC01及其前体的B细胞系［58］。最近，同一研究团队设计的N332-GT2免疫原在小鼠体内成功诱导了相对广谱的结合抗体［59］。目前为止，由于具有一定中和程度的广谱中和抗体尚未能在这类人源化小鼠体内诱导出来，这一策略仍需进一步改进和完善。

5 结语

回顾艾滋病疫苗30多年的发展历程，我们可以从中总结宝贵的经验教训。艾滋病疫苗研究主要经历了应用与理论指导应用两个重要时期。传统经验模的失败促使疫苗学家开始关注疫苗诱导机体免疫保护的理论研究。美国国立卫生研究院疫苗研究中心（Vaccine Research Center，VRC）和艾滋病疫苗免疫中心（Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology，CHAVI）的成立促进了艾滋病疫苗研究从应用到理论的重大转向，许多资金投入到HIV-1病毒免疫学、病毒学和结构生物学研究中来，取得了一系列重大的研究成果，极大地推动了疫苗研究的发展。RV144临床III期试验得到的微弱保护结果和最近HVTN702临床III期试验的失败进一步凸显了诱导bnAb的重要性。近年来，一系列bnAb的分离以及抗体进化机制的阐明使得通过设计新型免疫原来诱导bnAb成为可能。可是目前基于抗体进化机制设计的靶向胚系B细胞抗原仍未能在非人类灵长动物模型内诱导bnAb，研发有效的艾滋病疫苗仍然任重路远。另外，动物模型的局限性以及HIV Env异常的免疫原性也进一步增加了艾滋病疫苗挑战。尽管面临诸多挑战，希望不断积累的病毒学、免疫学以及结构生物学理论成果可以帮助人类成功地研制可以遏制HIV-1流行的艾滋病疫苗。