基于PERK/ATF4/CHOP通路探讨普伐他汀对棕榈酸诱导心肌细胞损伤的影响

刘 涛,李 晶,鲍翠玉

(湖北科技学院1. 附属第二医院、2. 糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

有研究报道，棕榈酸(palmitic acid，PA)通过上调内质网凋亡信号通路相关蛋白PERK、ATF4、CHOP表达水平诱导H9c2心肌细胞凋亡[1]。普伐他汀(pravastatin)属于他汀类调脂药物，可减轻心脏微血管内皮细胞氧化应激损伤，有效降低心血管疾病死亡率[2-3]，但pravastatin以何种途径参与心肌细胞脂毒性损伤的调控机制研究较少。本研究将探讨Pravastatin 对高脂造成心肌细胞凋亡的保护作用及其与内质网凋亡通路中PERK/ATF4/CHOP途径的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料H9c2心肌细胞系购于上海通派生物有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自维格拉斯生物技术公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT检测试剂盒购自众一生物科技有限公司；Pravastatin、PA购自美国Sigma公司；一抗购自英国abcam公司；二抗购自美国Abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1细胞增殖率检测 将盛有细胞的96孔板置于37 ℃二氧化碳培养箱24 h，待细胞贴壁后，根据实验设计，分组给药继续孵育。每孔加入20 mL MTT，孵育4 h。弃去孔内原液体，避光环境下，加入150 mL DMSO。在570 nm处检测OD值。

1.2.2ROS水平检测 向载有玻片的6孔板内加入细胞，在37 ℃二氧化碳培养箱内放置24 h，待细胞贴壁后，分组给药继续孵育，DMEM培养基洗涤2遍后，加入1 ∶500 ROS工作液，37 ℃，5% CO2培养箱内孵育20 min，PBS液洗涤3遍、加入适量DAPI，室温避光孵育10 min，洗涤封片后用荧光显微镜观察细胞内荧光。

1.2.3免疫印迹法检测 测定各组细胞裂解后蛋白浓度，在槽内加入每组蛋白样品，进行蛋白电泳、转模、封闭后，用下列一抗孵育过夜:GRP78、CHOP、p-PERK、PERK、ATF4、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。随后孵育二抗1 h，用增强化学发光试剂、凝胶成像系统检测蛋白。

1.3 统计学方法使用GraphPad Prism5进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 Pravastatin 对高脂诱导的心肌细胞增殖率低下的影响MTT实验结果发现PA刺激心肌细胞后，细胞的增殖率随着浓度和时间的增加，细胞增殖率逐步降低，为了实验的便利性，我们将PA的有效预处理浓度设定为0.4 mmol·L-1，预处理时间设定为24 h。Pravastatin 在10 μmol·L-1预处理时，心肌细胞增殖率明显升高(P<0.05)，而20 μmol·L-1组10 μmol·L-1与对心肌细胞增值率差异无显著性(P>0.05)。所以选择了10 μmol·L-1的pravastatin进行下一步实验。

2.2 Pravastatin对高脂诱导的细胞内氧化应激的影响ROS用红色荧光标记，DAPI用蓝色荧光标记，PA组红色和蓝色荧光强度明显增强，出现形态学改变，说明细胞内ROS水平增加，并表现出凋亡特征。Pravastatin预处理后，细胞内ROS水平较PA组明显降低，表明pravastatin能降低高脂所致细胞氧化应激损伤作用。

2.3 Pravastatin 对高脂诱导的心肌细胞凋亡蛋白的影响PA 组 Bax/Bcl-2比值明显升高、 cleaved caspase-3蛋白表达水平明显上调(P<0.05)，Pravastatin预处理后，明显改善上述变化(P<0.05)。

2.4 Pravastatin对高脂诱导的心肌细胞PERK/ATF4/CHOP通路的影响PA组p-PERK/PERK、ATF-4、GRP78、CHOP表达均明显增加，pravastatin预处理后，上述蛋白表达明显下降。Pravastatin预处理后，明显改善上述变化(P<0.05)。

3 讨论

本研究结果证实棕榈酸能抑制H9c2心肌细胞的生长、增加细胞内ROS水平，并上调促凋亡相关蛋白表达水平，pravastatin预处理后可以明显改善上述变化，有效抑制H9c2心肌细胞凋亡。

本研究重点分析了pravastatin与PERK/ATF4/CHOP信号通路作用机制的相关性。有研究报道，PERK/ATF4/CHOP信号通路的活化，触发内质网应激引起细胞凋亡[4]。本研究结果提示，高浓度的棕榈酸显著上调H9c2心肌细胞细胞内PERK/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达水平，而pravastatin预处理可以明显改善上述变化。

综上，pravastatin能逆转PA所致的H9c2心肌细胞增殖力下降，改善心肌细胞氧化应激损伤。其作用机制可能通过调控PERK/ATF4/CHOP信号通路，抑制内质网应激，减轻高脂诱导心肌细胞氧化应激损伤。