Ca2+与类风湿关节炎的相关性研究❋

杨 越，李 露，崔玮璐，曹 炜

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)主要临床表现为侵蚀性、对称性多关节炎且主要累及小关节，是一种慢性、全身性自身免疫性疾病。其基本病理特点为滑膜炎和血管翳形成，随着病情的发展会逐渐出现关节软骨以及骨的破坏，在此基础上最终可能导致关节的畸形和功能的丧失[1]。在我国，RA的患病率在0.2%～0.4%左右[2]。RA病因复杂，主要与遗传、激素、环境、免疫紊乱等有关[3]，但其发病机制尚未彻底研究清楚。中医主要认为其与内正气虚、外邪气盛有关，属于“历节”“痹病”等范畴。临床上西医针对RA的治疗仍以药物治疗为主，包括非甾体类抗炎药、糖皮质激素、改善病情的抗风湿药、植物药制剂以及生物制剂等，其不良反应尚多；中医辨证论治针对不同类型的患者采取个体化中医药治疗方案，不良反应少。钙离子(Ca2+)是一种重要的信号分子，在机体内调控着广泛的生物功能。Ca2+几乎影响到细胞生命的各个方面，参与凝血、肌肉收缩、神经递质及激素的合成等各种基本细胞功能。有研究[4]发现，Ca2+在RA的发生发展中起着关键作用，而很多中药可以调控Ca2+，基于对此的探索，可能会为RA的诊断、治疗以及发病机制带来更开阔的思路。

1 RA中Ca2+在骨代谢中的标志作用

RA患者在病理上除表现为滑膜炎、血管翳之外，还有一个重要的病理特点即骨质破坏，这也是RA患者后期致残的根本原因。不采取任何治疗措施的RA患者2年致残率达50%，3年致残率可达70%，将近50%的RA患者因为致残而最终丧失劳动力[5]。骨质破坏致使骨代谢失衡，如骨再吸收增加致钙离子释放入血形成的高血钙，以及骨生成标志物骨钙素水平的下降。

1.1 骨再吸收增加与高血钙

骨再吸收的本质为破骨细胞分解吸收骨的过程，它是RA中骨丢失导致骨质破坏的一个关键环节。有文献[6]报道，白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、核因子-κB(nuclear factor -κB,NF-κB)受体激活剂(nuclear factor-κB receptor activator,RANKL)和甲状旁腺相关肽(parathyroid peptide,PTH rP)等细胞因子及激素可以刺激骨再吸收，而IL -6 、RANKL以及PTH rP的表达被证明与RA患者活化的滑膜成纤维细胞血管翳侵入相关。与恶性疾病类比，RA中的血管翳就如恶性肿瘤一样侵入相邻的骨及软骨，并与恶性疾病患者的骨质溶解相似，RA患者的骨再吸收增加也会伴随着血钙的升高。刘富强[6]等以146例RA患者研究血清钙离子与疾病之间的关系时发现，有30.1%的受试者血钙过高，且血钙高的RA患者疾病活动度较血钙正常患者高。

血清中钙离子水平由骨再吸收、肠道吸收、肾脏重吸收及经肾脏排泄共同决定。在刘富强等研究中发现：(1)1,25-二羟基维生素D3(1,25D3)水平与C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)和IL -6 呈负相关，即患者血清中1,25D3 的水平与疾病活动负相关，而钙经肠道吸收主要受1,25D3 水平和作用的影响，因此疾病活动度高的RA患者血清中低水平的1,25D3提示肠道钙吸收相对减少；(2)RA患者血清免疫活性甲状旁腺素水平与疾病活动指标(ESR 、IL -6)、血清钙离子呈现负相关性，且血清钙离子水平与晨尿中钙/肌酸酐的比率呈正相关性，而肾脏重吸收钙需要甲状旁腺素的参与，这表明高疾病活动度对应低水平甲状旁腺素，从而导致肾脏重吸收减少；(3)尿中吡啶醚(pyridinoline,PYD)/肌酸酐和脱氧吡啶醚(deoxypyridinoline,DPD)/肌酸酐与ESR、CRP及IL -6呈显著正相关，PYD和DPD是骨代谢特异的生化指标[7]。由此可以看出，RA患者的高血钙与肠道吸收、肾脏重吸收及排泄相关性低，而与骨再吸收增加相关性高，并且高血钙的水平可能预示着与疾病活动相匹配的骨量流失。

1.2 骨生成标志物骨钙素

骨钙素作为骨生成的标志物，骨钙素水平下降代表骨生成减少，不能发生正常的骨化，这也是RA患者发生继发性骨质疏松以及关节畸形的原因。骨钙素是一种钙结合蛋白，由成骨细胞分泌，其分泌的骨钙素可以被重吸收成为骨基质的组成部分，还有一部分会分泌至外周血液循环。因此检测血液中骨钙素水平，可以显示骨生成的动态变化[8]。曹贤[9]等在实验中发现，按关节功能分级的实验组患者骨钙素水平低于健康对照组，差异有统计学意义，并且随患者关节功能分级的增加，骨钙素水平逐步下降，这表明新骨生成在逐步减少。在葛金莲[10]等实验研究中发现，经糖皮质激素治疗的RA患者发生骨质破坏时，最开始出现的是血清骨钙素水平降低。然而在王鑫[11]与Terpos[12]的研究中，RA患者血清骨钙素水平高于健康对照组，对此可能的解释为在骨吸收增加的同时，机体会产生代偿性骨形成，这或许与关节畸形有很大关联。出现这样的实验结果可能与实验条件的控制有关，如病例的选择、检验误差等，但其病理本质仍然为关节骨质的破坏，因此临床医生要根据不同时期骨钙素的实际水平做出谨慎判断。

2 RA中的钙结合蛋白

虽然RA具体的发病机制尚未完全研究清楚，但目前的一些研究发现，钙结合蛋白在RA的发病机制中有着不可小觑的媒介地位。

2.1 钙卫蛋白

钙卫蛋白(calprotectin,CLP)是S100A8/S100A9异二聚体，属于S100蛋白家族，来源于中性粒细胞和巨噬细胞。先前的研究显示，CLP在炎症反应中发挥重要作用，其可激活被晚期糖基化终末产物受体(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)或Toll样受体(TLR)感知的先天免疫通路。CLP与TLR4结合后能产生广泛的中性粒细胞效应，从而生成细胞因子、基质金属蛋白酶、趋化因子以及活性氧。CLP的水平随着中性粒细胞的激活而增加，并能增强中性粒细胞的氧化，还可直接诱导微血管内皮细胞产生明显的炎症和凝血反应[13]。最近有文献[14]报道，RA患者的血液和滑膜液中CLP水平升高，在动物关节炎模型中，CLP的缺失几乎完全阻止软骨的破坏，CLP可促进巨噬细胞和内皮细胞产生细胞因子，调节软骨细胞凋亡，并发现CLP水平与RA患者的临床症状、实验室参数、疾病活动、超声和放射学进展以及治疗反应密切相关。此外，钙卫蛋白还可以使T细胞的极化倾向于Th17极化。体外研究表明，S100A8通过RA滑膜细胞刺激IL-6表达，进而促进Th17的分化[15]。还有研究发现，当抗风湿药物逐渐减少时，RA患者的钙卫蛋白水平会升高，不过由于数据不足，还需要更多的实验研究来证实钙卫蛋白是否可以作为RA患者逐渐减少或停用抗风湿药物的生物标志物[16]。以上研究表明，CLP可能作为一种生物标志物参与RA的病理过程，对于钙卫蛋白的深入研究将为RA的发病机制带来新的发现。

2.2 钙网织蛋白

钙网织蛋白(calreticulin,CRT)也是一类钙结合蛋白。最开始的研究显示，CRT作为内质网钙结合蛋白，其含量水平与内质网钙存储能力成正相关，因而在调节机体钙平衡中有着重要的地位[17]。更多的研究发现，钙网织蛋白是一种多功能蛋白，在体内具有多种生物功能，并发现其可能参与RA的形成与发展。在天津医科大学郑芳教授课题组的研究中发现，与健康对照组比较，RA患者的血清CRT含量高于对照组，其含量水平与疾病活动度显著相关，且CRT在RA滑膜组织中也呈现高表达状态。进一步的机制研究探索到，CRT可与TRAIL(凋亡分子)结合进而抑制TRAIL诱导的JurkatT细胞凋亡，从而引发RA炎症[18]。高表达的CRT还可通过激活PI3K/Akt和STAT3信号通路，使RA滑膜成纤维细胞中抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1表达上调，通过PI3K/Akt-eNOS-NO信号通路，促进新生血管的形成[19]；通过上调抗凋亡基因c-FLIP，使RA滑膜成纤维细胞产生凋亡抵抗，进而发生滑膜增厚和血管翳。研究还发现，c-FLIP的表达激活了NF-κB信号通路，引发血管新生、释放炎症因子等病理过程，导致持久的关节滑膜炎症浸润[20]。课题组还发现，在RA患者的血清和关节液中，CRT与黏附分子sICAM-1和sVCAM-1的含量均呈现正相关关系。且实验结果提示，CRT可能是通过PI3K/Akt/eN0S信号通路调节黏附分子的表达，继而引发RA滑膜炎症[21]。国外有研究发现，细胞表面CRT作为RA共享表位(HLADRB1等位基因编码的5个氨基酸序列基序)的信号传导受体，参与共享表位传导Th17极化信号，从而在RA中发挥致病作用[22]。以上研究表明，钙网织蛋白对RA的发生发展有着多方面的影响，可能是RA发病机制中的一个重要环节。

3 Ca2+稳态

Ca2+是钙信号系统的信使，细胞内质网钙库中的钙释放能够触发钙信号，进而传导体内的生物信息，以完成机体的各种功能需要。内质网中的Ca2+处于稳态平衡才能确保钙信号的准确传导，一旦Ca2+水平失衡就会导致细胞生理功能失常，从而引发各种疾病。先前有报道发现，Ca2+作为第二信使在基因转录、细胞运动、增殖、凋亡以及免疫反应中有信号传导作用[23]。更有研究显示，胞内Ca2+信号与自身免疫性疾病的发病机制有关，如RA[24]。

近年来，Ca2+信号与RA的相关研究逐步增多。Yoon[25]等发现，中药雷公藤的生物活性成分雷公藤红素能够促进Ca2+动员介导的内质网应激，而Ivo R[26]等在RA患者的滑膜成纤维细胞中发现，雷公藤红素治疗后内质网应激产生的Ca2+动态变化，可以调节炎症基因表达谱，雷公藤红素显著下调了一些与RA滑膜成纤维细胞病理生理控制相关的基因表达。并经验证后发现，这些基因产物所介导的分子通路，可能在RA滑膜成纤维细胞中形成一个复杂的网络并相互串扰，其中涉及到Ca2+参与的钙蛋白酶/钙调蛋白-钙调神经磷酸酶-NFATc3信号轴。该信号轴本身是一个Ca2+相关通路，在RA发病过程中不可避免地调节软骨分解代谢、破骨细胞形成、血管生成和炎症[27]。当Ca2+内流时，钙传感器蛋白钙蛋白酶和钙调蛋白与阳离子结合并激活钙调神经磷酸酶，进一步去磷酸化NFATc3[28]，激活下游的炎症通路。Vincent Kam[29]等在进一步的研究中也发现，雷公藤红素确实可以通过激活Ca2+信号通路，下调RA滑膜成纤维细胞的炎症反应基因，从而缓解RA患者的症状。研究还发现，雷公藤红素可通过触发Ca2+信号诱导RA滑膜成纤维细胞的自噬性细胞死亡，且钙信号传导阻滞后会减弱雷公藤红素的体内外作用。Yune-Jung[4]等还发现，在免疫应答的过程中，T细胞和B细胞抗原受体结合后会诱导细胞内Ca2+存储下降，然后激活钙库操纵性钙内流，从而提高细胞内Ca2+的浓度。由此可见，调节胞浆内Ca2+的分布可能是未来治疗RA的一种策略，相关研究为此方面药物的研发提供了科研思路，有助于开发新的治疗方式或改进传统治疗方法。

4 中药对Ca2+的影响

有研究发现，中药可调节Ca2+进而缓解病情，这进一步表明Ca2+与RA发病密切相关，同时也说明中医药治疗RA不仅有良好的临床疗效，也有令人信服的科学研究依据。杨庆万等[30]在临床实验中，将长期接受激素疗法的RA患者分为治疗组口服甲泼尼龙片、甲氨蝶呤片、碳酸钙D3片并服用中药引火汤；对照组口服甲泼尼龙片、甲氨蝶呤片、碳酸钙D3片，相比之下治疗组在降低甲状旁腺激素，改善25-羟基维生素D3、L2-4骨密度平均值水平方面较对照组强，并发现引火汤可以平衡长期口服抗风湿药物RA患者的骨代谢及钙磷代谢。陈慧等[31]通过网络药理学发现，四妙丸可经钙调蛋白1-单加氧酶活性的正调节等生物过程对RA发挥疗效。甘小明[32]在补肾化瘀法对早期RA骨代谢影响的实验中，对照组口服阿法骨化醇软胶囊加钙尔奇D片，实验组采取补肾化瘀法加减治疗，治疗后显示2组在血钙、骨密度方面差异有统计学意义，中药补肾化瘀法疗效显著，并可促进RA患者骨矿物质的沉积。RA后期出现的骨质疏松，中药对其也有良好的改善作用。庞学丰等[33]运用补肾抗风湿中药寒痹康汤联合西药治疗RA继发骨质疏松患者，治疗后患者的临床症状及骨代谢状况明显改善。李杰[34]运用右归丸加减汤剂治疗骨质疏松症后发现，患者骨吸收指标(血清I 型胶原羟基端肽降解产物)显著下降，骨形成指标(1型原胶原N-端前肽)也降低，而骨密度较治疗前增高。

以上中药对 Ca2+的影响，包括提到的中药成分雷公藤红素能够促进Ca2+动员介导的内质网应激，最终都能达到治疗RA的目的，说明Ca2+对RA的发生发展至关重要。但是目前尚缺直接的实验证据，钙结合蛋白等标志物与Ca2+水平及分布关系等方面的实验研究有待进一步发展。

5 小结

骨代谢中骨再吸收增加会导致血钙水平增高，此时高水平的血钙是因为骨中钙离子释放入血，所以尽管RA患者血钙浓度高，患者仍然需要进行补钙，防止因骨钙缺失而出现骨质疏松的情况。另一方面，机体的血钙自稳系统虽然会及时纠正机体的血钙水平，但当机体长时间处于大量缺钙状态时，血钙自稳系统无法发挥它的作用，而此时甲状旁腺在缺钙的刺激下大量地分泌甲状旁腺素，进而引起骨钙降低、血钙以及软组织钙含量的增加。由此可以看出，缺钙时机体血钙浓度未必只出现降低这一种情况。因此活动期RA患者即使发现血钙升高，也要警惕可能发生的骨质破坏，在RA病程中时刻注意钙含量的补充。骨钙素水平的降低代表骨质破坏，它与高血钙都对RA的预判和治疗有着指导意义。

钙卫蛋白、钙网织蛋白以及Ca2+稳态是类风湿关节炎发病机制中的重要环节，它们在血液、滑膜液以及胞浆中的分布影响RA病情的进展，但这些由Ca2+参与的重要标志物与血钙变化水平的相关性研究尚缺，对此的研究可能有助于RA发病机制的深入探讨。另外，相关中药影响Ca2+的研究不仅为RA的中医药治疗提供科学依据，也为进一步揭示RA发病机制及治疗RA探索了新的路径。

以上这些为药学专家以及科研人员提供了治疗RA的新思路，可以从中探寻新的药物靶点，从而为治疗RA带来新的治疗策略。如从Ca2+角度进行RA发病机制的相关研究，进一步揭示RA病因病机，探寻与雷公藤红素相类似可以影响Ca2+分布的药物成分及能够平衡体内钙浓度的中药及其药物成分等。