肠道微生态在中医药领域的研究*

张佳缘，曹 刘，王云霞，晋瑜霞，肖 啸，张 琦△

(1. 成都中医药大学， 成都 610072； 2. 四川省中西医结合医院，成都 610041)

中医学历经数千年的发展，为中华民族的繁衍昌盛作出了巨大贡献。由于其独特的理论体系，现代医学难以对其理论、疗效的生物学机制进行本质性的诠释。近现代中医界乃至国际科研界运用现代科学技术对中医理论、诊法、治法、方剂、中药等各个方面不断深入研究，试图运用现代科学方法探索中医学的科学内涵。随着微生态学的兴起，作为人体存在寄生生命最多的肠道微生态系统，逐渐成为全球的研究热点。由于肠道微生态系统与中医理论系统都体现了整体、平衡、动态变化等特点，因此中医研究者不断尝试以肠道微生态系统为切入点，研究中医学相关理论及方药疗效机制。本文将从证候研究、舌诊研究、脏腑相关性理论研究、中医治法方药研究4个方面，分析基于肠道微生态的中医药相关研究，以求探索未来相关领域的发展方向。

1 肠道微生态与中医药理论

健康成年人的肠道内定殖着多达100万亿个微生物，至少包括30个属500种细菌，是人体微生物栖息最多的部位，如此庞大数量的微生物及其生活的环境等构成了肠道微生态[1]。2007年美国国家卫生研究院(national institutes of health，NIH)首先提出人体微生物组计划(human microbiome project，HMP)[2]，肠道微生物开始成为国际科研界的焦点。经过不断的研究发现，肠道微生态系统作为人体最大的互利共生有机统一体，参与人体物质代谢、免疫调节、信号传导等重要生命活动[3]。目前肠道微生物的检测方法主要包括分子生物学方法以及高通量测序技术两大类[4]。运用传统分子生物学方法检测肠道微生物，可检测的种类较少且只能针对已知的微生物进行分析。而高通量测序技术检测微生物的范围广、种类多，且可进一步进行基因功能注释，分析肠道菌群在宿主生命活动中的具体功用[5]。目前高通量测序技术已经广泛应用于肠道微生态研究，肠道微生物宏基因组学的研究也已经成为国际科学界的前沿热点。

有学者进行了纯理论分析，认为肠道微生态恒动性、整体性等特点与中医基础理论中的整体观、系统观、恒动观、平衡观、阴阳理论、正邪理论、藏象理论等有相通之处[6-7]。19世纪80年代，我国微生态学创始人魏曦教授预言“微生态学很可能成为打开中医奥秘大门的一把金钥匙”[8]，首次将微生态概念引入中医药领域的科学研究。经历了几十年的发展，基于肠道微生态进行的中医学科研工作取得了一定的成果。

2 基于肠道微生态的中医药研究

2.1 证候研究

脾胃为后天之本，运化水谷精微、生成气血津液用于人体生命活动，这与现代医学中肠道微生物参与食物消化吸收的功能相似，肠道菌群失调的症状与中医脾胃虚弱的厌食、腹泻等表现类似。危北海于1984年提出“系统而深入地分析肠道菌群状态，是研究脾胃疾病的生理病理变化的一个重要途径”[9]。因此，中医药领域基于肠道微生态开展得较早、较全面的研究集中于脾胃系统，如脾虚证型、湿热证型的实质性研究。

2.1.1 脾虚证型 严梅桢等[10]较早地运用传统培养法研究大黄水煎液灌胃制备的实验性脾虚小鼠，发现脾虚模型小鼠出现了以双歧杆菌、乳杆菌菌量下降为主要表现的肠道菌群紊乱。 刘晋生[11]等发现，脾气虚证的胃和十二指肠疾病患者肠道致病菌的检出率最高，因此脾虚证的部分生物学机制可能为肠道菌群的失衡。有研究[12]将脾虚模型大鼠与肾虚模型大鼠进行对比，发现脾虚模型大鼠粪便中革兰氏阳性杆菌和霉菌的比例增加，革兰氏阴性杆菌的比例下降，且优势菌种以金黄色葡萄球菌、厌氧梭状芽胞杆菌和白色念珠菌此类正常状态下肠道含量极少的菌种为主，而肾虚模型大鼠未出现肠道菌群的改变。由此推断，肠道菌群的改变可能是脾虚证的特异性生物学指标之一。后续运用类似传统培养方法对脾虚证进行研究的结论可大致总结为肠道正常有益菌群的减少[13]，或厌氧菌的减少[14-15]，如双歧杆菌、乳酸杆菌；条件致病菌的增多，如梭菌、葡萄球菌等[16]。由于传统培养法检测的菌群种类过少，研究范围局限，其他分子生物学方法也被逐渐应用于脾虚证型的研究。王卓[17]通过分析对比番泻叶煎剂制备的脾虚模型大鼠造模前后肠道菌群的肠道细菌基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic-consensus polymerase chain reaction, ERIC-PCR)指纹图谱发现，脾虚证型特异性表现的分子评价指标主要包括脾虚相关特征条带390 bp的净面积与丰度数值、ERIC-PCR指纹图谱多样性指数以及健康-脾虚Sorenson配对相似性系数。后续研究[18]在分析肠道菌群结构的同时观察肠道微生物代谢产物短链脂肪酸的变化。刘佳[25]等对老年脾虚患者肠道菌群进行16S rDNA变性梯度凝胶电泳分析，发现脾虚患者与健康人指纹图谱比较出现特征性变化[19]。

随着高通量测序技术在肠道微生态领域的广泛运用，中医药科研界也开始运用该技术研究脾虚证型肠道菌群的变化。李文艳运用16S rDNA技术[20]对非酒精性脂肪性肝炎患者粪便标本进行研究，发现与健康受试者对比肝郁脾虚证患者肠道菌群中的柔膜菌门菌群相对丰度明显降低，酸杆菌门纲目、腐生螺旋菌纲目、葡萄球菌科属、红螺菌科菌群丰度增高，说明该证型的非酒精性脂肪性肝炎患者的肠道菌群发生了独特变化。有研究[21]运用高通量测序方法发现，脾虚湿困型痛风患者厚壁菌门、变形菌门所占比例较正常人明显上升，而拟杆菌门、梭形杆菌则大幅下降。由此可知，实验技术的发展，使研究逐渐由特定菌群转变为整体多样性及丰度等的研究，并开始与肠道微生物代谢产物如短链脂肪酸等逐渐结合。

总的来说，脾虚证基于肠道微生态的研究，既往主要采用传统分离培养以及分子生物学方法，近年已经开始尝试运用高通量测序技术进行研究。运用传统培养方法进行的研究多针对脾虚证型状态下肠道特定种类菌群的含量变化，早期研究针对的菌群单一(多研究以双歧杆菌、乳酸杆菌等为代表的肠道益生菌)，后续研究增加了菌群的种类，对比研究厌氧菌与需氧菌，肠道正常菌群与条件致病菌、致病菌。目前研究显示，脾虚证型在肠道微生态的表现多为肠道益生菌的减少，或伴有肠道条件致病菌和(或)致病菌的增加；厌氧菌的减少，需氧菌的增加。基于分子生物学方法发现，脾虚证型肠道微生物的多样性下降，与健康状态肠道菌群结构的相似性下降。目前通过高通量测序技术研究脾虚证的报道相对较少，多为临床研究，不同疾病过程中脾虚证型肠道微生态的表现不尽相同，未来需要多病种、多层次的深入研究了解脾虚证肠道菌群相对精确的表现趋势。

2.1.2 湿热证型 随着对脾虚证研究的逐步开展，湿热证型也逐渐引起研究者们的注意。江月斐等[22]通过传统培养计数方法研究显示，脾胃湿热证肠易激综合征患者肠道革兰氏阳性杆菌比例明显下降，而革兰氏阴性杆菌及革兰氏阳性球菌比例明显上升，且与脾气虚证比较革兰阳性杆菌比例以及肠道菌群密度明显升高。付消岩等[23]发现，慢性腹泻脾胃湿热证患者肠道中的需氧菌肠杆菌、肠球菌较脾虚证明显增多，B/E(双歧杆菌/大肠杆菌)比值高于脾虚证组，厌氧菌双歧杆菌、乳杆菌亦高于脾虚证组，与脾虚证比较呈现出不同程度的菌群失调趋势。吴宛蔚[24]对湿热证型便秘患者的粪便进行分离培养发现，此类病人肠道双歧菌、乳杆菌减少，肠球菌、霉菌增多。陈晓刚[25]运用实时荧光定量PCR技术(Real time Quantitative PCR，RT-qPCR)研究发现，再发性腹痛脾胃湿热证儿童与脾胃湿热证对比，双歧杆菌和肠杆菌含量显著增加，B/E值升高。王婷等[26]运用RT-qPCR技术检测不同湿热动物模型肠道菌群，发现不同发病机制的湿热证型肠道菌群表现不尽相同。脾阳虚为内湿基础的湿热证模型小鼠双歧杆菌属、乳杆菌属含量减少，湿邪困扰为内湿基础的湿热证则表现为双歧杆菌属、乳杆菌属含量增多。高通量测序研究[27]发现，溃疡性结肠炎湿热内蕴证、脾胃湿热证以及脾胃气虚证3种证型患者之间肠道菌群的差异性可能存在于厚壁菌门和变形菌门的构成比。

对这些研究成果进行总结可发现，湿热证型与脾虚证型相较而言在肠道菌群结构方面的表现有以下趋势：菌群密度及多样性升高，肠道菌群条件致病菌和(或)致病菌增加，或伴有肠道厌氧菌的减少、B/E比值升高。除此之外，基于高通量测序技术的研究相对较少，多局限于溃疡性结肠炎湿热证，难以集中总结湿热证在肠道菌群门、纲、目、科、属、种的变化趋势。

2.1.3 脏腑相关性理论研究 基于肠道微生态进行的脏腑相关性理论研究主要集中在“肺大肠相表里”实质性研究。“肺与大肠相表里”理论源于《黄帝内经》，肺与大肠在经络结构、生理、病理上相互联系，手太阴经属肺络大肠，手阳明经属大肠络肺。肺气的肃降与肠道的功能密切相关。肺气失于肃降可导致大肠传导失司；腑气不通、大肠传导不畅亦可致肺气壅塞。“肺与大肠相表里”理论中的“肺”与现代医学中的呼吸系统相关，而“大肠”与解剖器官肠道类似。近年来肺与大肠相互联系机制的研究逐渐深入，如两者组织结构同源性、内分泌机制等方面，而肠道微生态也是研究肺脏与肠道生物学联系的重要切入点。总体而言，肺系疾病可以导致肠道菌群的变化，两者可相互影响。进一步研究显示，在肺系疾病(慢性支气管炎)与肠系疾病模型(溃疡性结肠炎)中，肺肠菌群部分存在同步规律性变化[28]。临床研究发现，肺系疾病患者与其他系统疾病患者对比纳差、便秘、便溏等症状的发生率较高，肠道存在明显趋向异常的革兰氏阳性球菌[29]。方骞等[30]发现，喘息性支气管炎患儿在患病初期就出现了肠道菌群失调，表现为B/E值降低。除此之外，肠道菌群的变化亦可引起肺部微生物群的改变，可能导致肺部的病理损伤[31]。基于“肺与大肠相表里”理论，研究者通过汗法、宣肺利水法治疗呼吸道感染、非小细胞肺癌，缓解病情的同时也观察到肠道微生态的改变[32]。

“肺与大肠相表里”理论与肠道微生态相关的生物学机制可能有以下几个方面。当肠道菌群失调时，肠道中致病菌数量增加。这些致病菌可能通过消化道移行致口咽部，然后可能顺行至呼吸道[33]；由于肠道菌群失调时可能释放肠源性内毒素进入血液循环，经下腔静脉进入右心，经肺动脉和毛细血管最先到达肺脏[34]；肠道菌群改变引起其一些可能参与免疫的代谢产物含量及种类发生变化，从而影响肺部的免疫环境[35]。

2.2 舌诊研究

舌诊是中医诊法的重要组成部分，是辨证论治的重要依据。有研究认为，通过阐述舌苔菌群与肠道菌群的联系，可以研究患者中医体征与脏腑病变的物质联系[36]。

腻苔作为一种常见的病理性舌苔，与肠道微生态的相关性研究相对较多。腻苔主湿邪、痰浊、食积，与胃肠道及脾胃系统密切相关。研究发现，腻苔的形成与肠道微生态的改变有相关性，脾虚湿盛泄泻呈白腻苔的患者存在明显的肠道微生态失调及舌部菌群改变，且两者具有相关性[37]。由此推断，肠道微生态的改变可能为腻苔的生物学表现之一，但仍需进一步大范围的研究进行证实。

2.3 中医治法方药研究

2.3.1 健脾法及健脾方剂 随着脾虚证肠道微生态相关生物学实质研究的拓展与深入，健脾治法及方剂作用机制的研究也逐渐开展。目前健脾法影响肠道微生态的研究多通过经典健脾方剂参苓白术散、四君子汤、七味白术散、理中汤等开展。研究发现，参苓白术散不仅能促进肠道益生菌的增殖[38-39]，亦能修复肠黏膜，提高肠道局部的免疫能力[40]。如李姿慧[41]等发现，参苓白术散可以明显改善脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白表达，控制炎症反应促进肠道黏膜的恢复。董开忠[42]等发现，抗生素诱导的肠道菌群失调小鼠服用参苓白术散后，肠道乳酸杆菌、双歧杆菌等生理性细菌的增殖增加，而内毒素和P物质降低，说明参苓白术散不仅促进益生菌的增殖，还抑制了致病菌和条件致病菌的生长。四君子汤作用于肠道微生态，可促进肠道益生菌的增殖，提高肠道微生物多样性，改善肠道局部的免疫状态。孟良艳[43]较早运用16S rDNA测序技术发现，四君子汤可明显提高脾虚大鼠肠道菌群的多样性。分泌型免疫球蛋白(sIgA)是黏膜分泌的免疫球蛋白，反映着黏膜的局部免疫状态，肠道sIgA的产生、分泌、功能与肠道菌群密切相关[44]。较多研究基于肠道组织中局部sIgA含量，分析四君子汤对于肠道局部免疫的作用。经过四君子汤治疗后的脾虚泄泻小鼠肠道菌群结构改善(乳酸杆菌增多，大肠杆菌量减少)，回肠和盲肠sIgA含量增加[45]。运用中医推拿联合四君子汤[46]可改善β-内酰胺类抗菌药物相关性腹泻患儿的粪便球/杆菌比例、sIgA含量及血清二胺氧化酶、降钙素原(PCT)、IgG、IgA等免疫、炎症相关指标[46]。研究发现，理中汤可抑制肝硬化大鼠肠道肠杆菌、肠球菌、韦荣球菌，促进双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌增殖，降低血清内毒素及炎性因子水平，缓解肝脏纤维化，改善肝脏功能[47-48]。舒青龙[49]等运用16S rDNA高通量测序技术发现，理中汤可改善抗生素相关性腹泻模型小鼠的肠道菌群结构，增加肠道菌群的多样性。

健脾法、健脾方剂相关的研究，一方面针对肠道菌群种类、结构、多样性研究较多，另一方面对于肠道局部免疫的研究逐渐发展，已试图进一步探索肠道菌群的改变对于肠道局部乃至整个机体免疫的影响。

2.3.2 单味中药及中药单体 不同于中医复方的研究，中药方面除了研究单味中药对于肠道菌群结构的影响，还进行了中药有效成分的探索，并且重视肠道菌群与中药有效成分的相互作用。

从20世纪40年代开始，研究者们逐渐开始研究中药对微生物的作用[50]，到目前为止，从肠道菌群切入进行研究的中药主要分为两大类，一类为清热解毒药，一类为补益药，两者对于菌群的作用也主要为促进肠道有益菌群的生长，抑制致病菌的增殖。如崔祥等[51]发现，黄连提取物可显著抑制病原菌(肠杆菌、肠球菌)的生长，显著促进益生菌(乳酸菌、双歧杆菌)的生长。大黄对于肠道微生态的作用是双向的，大剂量大黄可导致肠道菌群的紊乱，这也是制备脾虚动物模型的方法之一。而在脓毒症、急性肾衰等疾病病理状态下，大黄可调节失衡的肠道微生态[52-53]。孙立群[54]等发现，纳米黄芪可改善溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群失调，使肠道双歧杆菌﹑乳酸杆菌含量明显上升，肠球菌﹑肠杆菌含量下降。有研究[55]发现，10～6kDa分子量的黄芪总多糖调节盐酸林可霉素灌胃小鼠的肠道微生态效果最好。宋克玉等[56]同时研究党参和茯苓(均为补益中药)对小鼠肠道菌群的影响，发现高剂量的党参能显著提高肠道乳杆菌水平，并降低大肠杆菌水平，而高剂量的茯苓能显著提高肠道双歧杆菌水平。

中药的给药方式多以口服为主，均需经过胃肠道的消化吸收，离不开肠道菌群的作用，经肠道菌群代谢后的中药成分才能成为最终的起效成分。因此基于肠道微生态的中药药物代谢学研究方向也成为目前中医界的研究热点之一。肠道微生物群与中药两者具有双重效应，肠道微生物群丰富的代谢酶系可以对中药成分的结构进行水解、氧化和还原、异构化等修饰反应，生成的代谢产物具有与其前体不同的生物利用度、生物活性和毒性，对中药成分可能具有减毒或增效等效应。另一方面，中药化学成分与肠道微生物群相互作用，可调节肠道微生物群的组成以恢复其稳态，从而改善其功能障碍以及相关的病理状况[57]。附子主要成分为乌头碱，有研究[58]发现，乌头碱经人体肠道菌群作用后会发生酯化反应产生新的单酯型、双酯型和脂类生物碱等，这些产物相对乌头碱毒性较弱。番泻叶本身的主要成分番泻苷不具有泻下活性，只有被肠道菌群转化成为代谢产物大黄酸后，才能表现出泻下的药理活性[59]。

单位中药及中药单体的研究主要以动物模型为主，但是动物模型难以还原人体肠道微生态环境，这对研究成果最终的临床适用性有一定的局限。中药研究是肠道微生态在中药领域应用的主要部分，多注重单药有效成分的提取与研究，对于多味中药、多种成分在肠道产生的具体生物化学效应研究较少，但中药疗效的产生往往基于多种化学成分、多种药物，所以单一药物、单一成分无法代表中药与人体肠道微生态相互作用的实际情况。

3 前景与展望

由于中医理论本身整体、动态变化等特点，以生态学角度研究中医理论实质、中医药作用机制具有广阔的研究前景。肠道微生态近年来已经成为国际研究热点，研究技术也随着现代分子生物学、生物信息学等飞速发展而不断地更新换代，但总体来说目前基于肠道微生态进行的中医药研究相对落后。一方面研究成果集中在菌群变化方面，缺乏进一步分子生物机制的研究；另一方面，多数研究所采用的传统培养研究肠道微生物的方法已经难以满足对于肠道整体复杂菌群的研究要求。因此，未来基于肠道微生态的中医药生物学机制研究应利用宏基因组等前沿的方法，研究中医药理论在肠道微生态方面的生物学表现以及中医药对于肠道微生态结构与功能的具体影响，并进一步挖掘相关分子生物学作用通路与机制，揭示中医药通过肠道微生态产生作用的本质。