DNA甲基化在类风湿关节炎中的研究进展①

陈 杏 魏 萌

（西部战区总医院风湿免疫科，成都610083）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）作为一类累及全球人口约1% 的系统性炎症疾病，以多关节、对称性、侵蚀性关节炎为主要症状，疾病发展后期可致关节畸形甚至残疾［1］。对RA 的致病机制进行较为全面的了解，有助于研发更为有效的治疗药物，为广大患者带来希望。基因和环境因素传统地被认为是导致RA 疾病的两大因素，然而近年来随着表观遗传学的飞速发展，越来越多的研究表明了表观遗传学也参与了RA 致病过程［2］。表观遗传学对外界刺激因子做出反应，在基因与环境之间形成桥梁，通过调节基因表达从而影响免疫系统的活动性。表观遗传改变，如DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 等，主要通过调节基因表达参与自身免疫性疾病的发病机制。其中DNA 甲基化是表观遗传学中研究热点，它是指以不改变基因序列为前提，在DNA 甲 基 化 转 移 酶（DNA-methyltransferase，DNMT）的作用下，在基因组CpG 二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合1 个甲基基团，大量研究表明其通过染色质结构、DNA稳定性、DNA构象、DNA与蛋白质相互作用方式的改变可影响基因的表达［3-4］。DNA 甲基化通过调节基因的表观沉默以及部分类型的细胞行为，在RA 发生、发展的各个阶段发挥作用，其在RA 发展中的潜在作用引起了临床医生和研究人员的极大关注［5］。

RA 是一种慢性自身免疫性疾病，其中成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）通过与滑膜中浸润的免疫细胞相互作用在RA 患者免疫应答的启动和持续过程中起着至关重要的作用，最终促进了关节软骨退化及近关节骨组织的侵蚀；而外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），如T 淋巴细胞和B 淋巴细胞通过与FLS 相互作用参与了RA 慢性炎症的持续。针对这些在RA 致病过程中有着重要意义的细胞类型，学者们对这些细胞进行了DNA 甲基化的研究，得到了一系列关于致病基因的甲基化状态信息。本文将对一些重要细胞类型的甲基化研究进行总结，进一步探索表观遗传学在RA 致病机制中的作用，同时为寻找RA潜在的生物标志物提供线索。

1 FLS

FLS 在RA 滑膜病变和关节破坏中起着关键的作用。以间充质成纤维母细胞样滑膜细胞为主的FLS 通过释放促炎细胞因子、趋化因子刺激软骨细胞分泌金属蛋白酶，从而降解了包括软骨和软骨下骨在内的所有结缔的组织成分，加重关节的破坏。对FLS 的DNA 甲基化进行深入研究可有助于揭示FLS在RA中作用的致病基因及其致病机制，从而寻找新的治疗靶点［6］。

目前为止，全基因组关联研究已识别出100多个RA 发生的风险基因［7］。RA 表观遗传学与转录组研究结合有助于对DNA 甲基化在基因表达中产生的影响及相互联系有更深的理解，从而促进表观遗传学在RA发病机制的研究发展。RA FLS的表观基因组、转录组和序列变异的数据综合分析共鉴定出2375 个差异甲基化基因、2947 个差异表达基因、74 个风险基因，通路分析发现357 组基因与RA 的致病过程密切相关［8］。其中，肢芽和心脏发育（limb bud and heart，LBH）基因被认为是与RA 发生、发展关联最强的基因。LBH 通过在细胞分裂周期G1 期阻止细胞分裂调控FLS 增殖，而LBH 低表达可能通过G1-S 期转化促进FLS 增殖而成为RA 风险基因［9］。 芯片 转 录组 分 析显 示，LBH 在 骨 关节 炎（osteoarthritis，OA）FLS中的表达是RA FLS的1.9倍，LBH 在RA 和OA 之间的表达差异恰好解释了RA 滑膜增生比OA 更严重的原因，因此通过促进LBH 在FLS 中的表达抑制FLS 增殖，从而缓解关节滑膜炎的症状，可能是新的治疗靶点［8］。

DNA 甲基化和转录组不仅在RA 和OA FLS 中有显著差异，在RA髋关节和膝关节FLS中也存在显著差异。DNA甲基化芯片鉴定出500个差异甲基化基因，其中285 个基因呈过度甲基化，210 个基因呈低甲基化，5 个在RA 膝关节FLS 中同时存在有过度甲基化和低甲基化的CpG 位点的基因［10］。此外，为了鉴定髋关节与膝关节FLS的甲基化差异是否可导致其功能差异，RNA 测序鉴定出107 个差异甲基化基因和若干条生物信号通路，发现在RA 与OA FLS中具有差异性的IL-6 信号通路在RA 髋关节与膝关节中也具有差异性，不仅如此，IL-6 在RA 髋关节的表达量是膝关节的10.8 倍，而炎症通路在RA 髋关节和膝关节的表达差异导致其在髋关节和膝关节的炎症和免疫反应也有差异［10］。这提示了RA 不同受累关节可能具有不同致病机制，RA 患者膝关节和髋关节的甲基化组和转录组差异可能导致其对高度靶向制剂治疗反应具有一定的差异性。

2 PBMC

RA 的初始疾病阶段与先天和适应性免疫系统的改变相关，两大免疫系统通过产生针对各种分子包括修饰的自我表位的自身抗体而加重自身免疫反应。在疾病的进展阶段，先天性免疫系统相关细胞（如树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）和适应性免疫系统的相关细胞（如T 淋巴细胞和B 淋巴细胞）与FLS 相互作用而参与慢性炎症状态的加重和持续［11］。

以淋巴细胞为主的PBMC 某些关键致病基因与疾病发生密切相关，研究发现RA患者PBMC中人类突 变 同 源 基 因1（human mutL homolog 1 gene，hMLH1）启动子呈异常超甲基化状态，这种状态影响hMLH1转录和蛋白表达，使错配修复蛋白基因功能丧失，最终导致RA 的发生发展［12］。而目前DNA甲基化在外周血中的研究主要是针对PBMC 中单一类型细胞如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞，有助于进一步了解RA表观遗传学在免疫学中的发病机制。

2.1 DNA 甲基化在T 淋巴细胞中的研究 有研究者通过将RA 患者外周血提取的各免疫细胞与健康对照组对比，发现RA 患者FLS 中的高甲基化CpG位点与其在外周血中CD4幼稚T淋巴细胞的高甲基化CpG位点相似［13］。这些相似的高甲基化CpG位点可能成为代表RA风险或疾病状态的生物标志物。

同时，DNA 甲基化通过与免疫通路相互作用可参与到炎症反应和免疫应答。例如，细胞因子IL-6可增加DNMT1的表达，其表达水平与T 淋巴细胞中的DNA 甲基化程度密切相关，且DNA 甲基化可调节T 淋巴细胞的分化、活化和迁移，而T 淋巴细胞活化又可导致IL-2 启动子的去甲基化，从而使IL-2 基因表达增加［14］。因此，免疫通路与DNA 甲基化相互作用促进了RA 炎症反应的发展，而这些关联可能通过DNA 甲基化介导、影响基因表达的调控、对抗原刺激的反应或选择性剪接，从而导致RA 易感性增加［15］。

此外，随着甲基化450 k 芯片的推进，一项研究将RA 患者和健康对照组PBMC 的全基因组DNA 甲基化和mRNA 表达谱进行了综合分析，发现若干个与RA 相关的干扰素调控基因，其中核糖多聚酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP9）基因甲基化差异最为显著，基因验证实验发现PARP9 表达减少可使细胞分裂停留在细胞分裂周期G1期，而过表达可促进Jurkat T 淋巴细胞的增殖，同时通过正向调控IL-2的分泌而参与炎症反应和RA免疫应答［16］。

2.2 DNA 甲基化在B 淋巴细胞中的研究 免疫细胞的表观遗传调控对RA 等自身免疫性疾病的发生和维持至关重要。B 淋巴细胞通过表达自身抗体加重自身免疫反应而与RA 的发生发展密切相关，表观遗传变异，如DNA 甲基化，则可能介导了B 淋巴细胞的致病性。一项研究使用甲基化450 k 芯片，对RA 组和健康组的B 淋巴细胞进行DNA 甲基化对比分析，发现一系列的差异甲基化基因，且通过与另一组系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）/健康对照组甲基化图谱分析，发现基因间区chr10p12.31 在两组实验中具有相似性，这一研究揭示了可能驱动RA 中B 淋巴细胞致病活性的基因，并提示了RA 与SLE 可能有共同的甲基化模式，表明DNA 甲基化在自身免疫性疾病的可能有共同的作用模式［17］。

此外，DNA 甲基化在免疫反应中的细胞分化过程中也有体现。DNA 甲基化特征在激活的B 淋巴细胞后代中被大量保留，产生的记忆B 淋巴细胞和浆细胞中显示出类似的表观遗传特征，其中发现DNMT 在记忆B 淋巴细胞中高度表达，而与免疫相关的基因则表现出了独特的DNA甲基化模式［18］。

3 DNA甲基化在治疗领域中的研究

表观遗传学不仅在RA 发病机制研究上有所进展，在治疗领域也有所突破。一些已广泛用于治疗血液肿瘤疾病的药物如5-杂氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-AzadC）可 抑 制DNA 甲 基 化，microRNA-124a基因通过编码非编码小RNA抑制细胞增殖，在RA FLS 中呈现出过度甲基化。ZHOU等［19］通过将5-AzadC 处理RA FLS 抑制其DNMT 活性，导致DNA 去甲基化，进而使染色质与转录因子结合促使miroRNA-124a 基因表达增加。因此，5-AzadC 通过抑制RA FLS 增殖有望在RA 治疗领域中为表观遗传学开启新的研究方向。

通常，发生在启动子区域的过度甲基化与基因表达沉默相关，而有时某些位点的过度甲基化可增强其所在基因对药物的反应性，提高治疗药效。MAESHIMA 等［20］通过计算与实验相结合的方法，在酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11 型基因（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）中发现了1 个内含增强子，该片段包括两个RA FLS 与OA FLS 相比下高度甲基化的CpG 位点（CpG 6/CpG 7），且对糖皮质激素受体有特异性应答；不仅如此，高度甲基化的6 号和7 号CpG 位点通过增强内源性糖皮质激素的增强子激活性来促进PTPN11 的转录，进而导致了RA FLS 中酪氨酸磷酸2（tyrosine phosphatase 2，SHP-2）的过表达；骨髓重建实验中发现SHP-2 的过表达促进了K/BxN 关节炎，而使用SHP-2 抑制剂治疗可减少RA FLS 的迁移，以及对肿瘤坏死因子和IL-1β 刺激的反应，从而降低小鼠关节炎的严重程度。通过对致病基因的异常表观遗传学特征影响FLS 生物学行为，靶向抑制SHP-2 的表达可缓解关节炎的症状，且不会影响高甲基化CpG 6/CpG 7 对糖皮质激素受体的特异性应答，这可能是RA新的治疗策略。

研究发现，在使用缓解病情的抗风湿药物治疗的早期RA 患者中，T 淋巴细胞、单核细胞、B 淋巴细胞显现出普遍的DNA 低甲基化，同时DNMT1 呈现出低表达趋势。不仅如此，TET（ten-eleven translocation）蛋白1、TET蛋白2、TET蛋白3等涉及DNA 去甲基化的酶呈现出过表达趋势。而通过甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）进行治疗后，发现T淋巴细胞和单核细胞的甲基化程度降低，B 淋巴细胞整体甲基化程度增加，且DNMT1 和DNMT3A 的表达有逆转下降的趋势［21］。这一结果说明RA患者的DNA 低甲基化对某些血细胞亚群具有特异性，并通过MTX 治疗能够逆转，而这些变化伴随着与甲基化有关的酶水平的平行变化，表明在这一水平上的可调控性。

有临床研究表明，接受及时有效的治疗后病情持续缓解的RA 患者出现长期残疾甚至死亡的可能性较小，但同时有高达40%的患者在接受治疗2年后仍无效，这一部分患者在炎症期间由于没有对药物治疗产生反应而增加了残疾的风险［22-23］。尽早识别与患者治疗反应相关的生物标志物可及时为患者制定个人化治疗方案。为探讨抗风湿药物治疗疗效是否与DNA 甲基化有关，一项研究利用甲基化450 k 芯片对患者在接受抗风湿病学药物前后的T淋巴细胞进行全基因组DNA 甲基化分析，发现其中有6个CpG 位点在对药物治疗有反应和无反应者之间呈现出明显差异的甲基化，并且发现血小板反应蛋白基序的解体蛋白和金属蛋白酶2（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 2，ADAMTSL2）以及嗜丁基蛋白亚家族3 成员A2（butyrophilin subfamily 3 member A2，BTN3A2）基因中的两个CpG 位点与治疗反应密切相关，提示药物治疗疗效与某些位点的甲基化状态相关［24］。此外，在一项将DNA 甲基化作为RA 肿瘤坏死因子抑制剂（tumor necrosis factor inhibitor，TNFi）治疗反应的生物标志物的全表观基因组关联分析研究中，观察到在无治疗反应者中低密度脂蛋白受体相关蛋白的伴侣蛋白1 基因（low-density lipoprotein receptor-associated protein chaperone1，LRPAP1）的7 号外显子中的4个CpG 位点的甲基化程度高于良好治疗反应者［25］。可以发现，治疗反应效果与某些基因位点甲基化程度相关。在制定治疗方案前，若能结合患者病情和相关基因甲基化情况，针对性选择患者治疗反应敏感的药物，可使治疗效果达到最佳，且为患者节省大量治疗时间，提高患者治愈率。然而治疗反应效果受多因素影响，且预测算法包含了对一组生物标志物的评估，这些标志物可能包括表观遗传、遗传和转录因子和血清学，评估治疗反应时还需考虑足够多的生物标志物，因此这可能成为DNA甲基化作为评估治疗反应的生物标志物的一大局限性［25］。

4 DNA甲基化作为病情判断的生物标志物

DNA 甲基化通过对某些关键致病基因进行甲基化修饰，影响其基因表达而在RA 致病过程中发挥作用，且RA 呈慢性进行性发展，在疾病发展的各个阶段可能具有特定的甲基化特征，因此识别这些特有的甲基化特征有助于对疾病发展的程度及预后做出准确的判断。

研究发现，细胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）和双特异性蛋白磷酸酶22（dual specificity protein phosphatase 22，DUSP22）基因启动子的低甲基化区域分别与RA 活动性和侵蚀性相关，而SHROOM1 基因在RA 早期与进展期FLS 中差异甲基化最为明显，提示基因甲基化与RA 疾病病情进展的关系密切［26-27］。此外，RA 作为以慢性全身炎症为特征典型的炎症关节炎，已有研究报道中性粒 细 胞/淋 巴 细 胞 比 值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）可能成为冠心病、肿瘤以及自身免疫性疾病如RA、大动脉炎等疾病发展的系统性炎症标志物［28-29］。研究发现从外周血DNA中提取获得的甲基化NLR（methylation-derived neutrophil to lymphocyte ratio，mdNLR）指数可以作为一种研究工具来评估近期发生且未经过治疗的慢性系统性炎症（systemic inflammation，SI），mdNLR 与共变量（年龄、性别、吸烟状态）相比，在区分新发RA 病例和对照组方面表现更好，用DNA甲基化数据评估的SI可作为RA 近期发病的标志［30］。DNA 甲基化作为RA 新的生物标志物及评价SI 的可能性促进了表观遗传学在临床研究中的应用与发展。

在技术手段上，检测DNA 甲基化的样本来源广泛，几乎所有的组织样本和体液都可以用来分析DNA 甲基化，包括福尔马林固定石蜡包埋组织、血斑、颊上皮、外周血、支气管吸入物、唾液和尿液等［31］。广泛的检测标本使这一技术应用到临床工作中成为可能。然而，DNA 甲基化这一生物标志物在应用于临床之前仍面临着许多问题：首先，缺乏统一标准的全基因组高通量技术，降低了DNA 甲基化分析的可信度；其次，DNA 提取和DNA 定量的效率可能会影响到最终结果的分析［32］。因此，将DNA甲基化应用于临床之前，逐一克服这些局限性可使表观遗传学更好地服务于临床工作。

5 小结与展望

本文通过对DNA甲基化在FLS和PBMC中的研究以及治疗领域进行了阐述总结，揭示了某些致病基因的异常甲基化状态及其致病机制，为RA 治疗提供了新的研究方向。此外，在RA 发展的各个阶段鉴别出了有意义的显著差异甲基化基因，有望成为判断RA 病情的生物标志物。然而，在DNA 甲基化应用到临床研究中还将面对很多挑战，鉴定出的差异甲基化基因还需经过更多的实验研究验证。通过对DNA 甲基化在RA 中致病机制的深入研究，有助于我们理解表观遗传学在RA 发病机制中的发挥的作用，并有利于寻找新的治疗靶点［33］。