树突状细胞交叉提呈的研究进展①

廖晓艳 高丰光

（厦门大学医学院基础医学部，厦门361102）

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是机体介导适应性免疫的重要抗原提呈细胞，其所诱导的适应性免疫应答对杀伤肿瘤、细胞内病原微生物等具有重要意义［1-2］。根据抗原的来源及性质，DCs 主要通过MHCⅠ类分子提呈途径、MHCⅡ类分子提呈途径和交叉提呈途径对抗原进行加工和提呈。MHCⅠ类分子提呈途径是指内源性的抗原被降解成抗原肽并装载于MHCⅠ类分子，提呈给CD8+T 细胞的过程；MHCⅡ类分子提呈途径是外源性抗原通过吞噬、胞饮、受体介导等内吞作用摄取抗原，装载到MHCⅡ类分子，提呈给CD4+T 细胞的过程；交叉提呈途径则是DCs 对外源性抗原的一种抗原提呈方式，即外源性抗原经DCs 作用后与MHCⅠ类分子形成复合体，提呈给CD8+T细胞的过程［3］。DCs可根据其功能及表面分子的不同，分为经典DCs（classical DC，cDCs）、浆细胞样DCs（plasmacytoid DC，pDCs）、朗格汉斯细胞（langerhans cells，LC）和单核来源的DCs（monocyte derived DCs，moDCs）等［4］。cDCs 又可根据其是否表达趋化因子XCR1 而进一步细分为XCR1+DC（cDC1）和XCR1-DC（cDC2）2 个 亚 类［5］。cDC1 是抗原交叉提呈的主要DCs 群体，在小鼠DCs中，相较于其他亚类，CD8a+DCs 是抗原提呈效率最高的，而在人类中，CD141+DCs 发挥同样的作用［6］。DCs 交叉提呈主要通过液泡途径和内体-细胞质途径完成［7-8］。在液泡途径中，外源性抗原被DCs 摄取后，在溶酶体酶被加工处理成抗原肽，在内体溶酶体器室中形成抗原肽-MHCⅠ类分子复合物，最后提呈给CD8+T细胞。它不依赖于抗原处理相关转运蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）及蛋白酶体［4］。在内体-细胞质途径中，DCs 表面受体内化的抗原先被从内体转运到细胞质，继而被蛋白酶体降解成分子量不等的抗原肽，再由TAP将抗原肽运回内体并与MHCⅠ类分子组装［7，9］。由于外源性抗原的相对分子质量较大，限制其通过内源性途径对抗原进行处理，而通过交叉提呈途径提呈抗原，可起到杀伤靶细胞的作用，因此，对DCs 交叉提呈的研究可对肿瘤免疫治疗提供新的潜在靶点和思路［10-11］。

1 内体环境对交叉提呈的影响

与巨噬细胞不同，DCs 的吞噬体pH 在7.5～8.0左右，以维持溶酶体酶的较低活性［12］。DINGJAN等［13］利用荧光共振能量转移技术，以外源性细胞色素C 进行实验，发现内体膜可通过脂质过氧化酶NOX2招募至吞噬体、诱导产生ROS、介导偏高的pH环境导致较多抗原从内体进入胞质，从而促进交叉提呈的发生。调节NOX2招募至吞噬体的作用靶点有Rab27a、转 录 因 子EB（transcription factor EB，TFEB）、VAMP8等分子。ALLOATTI 等［14］发现，短时间 的 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）刺 激 引 起Rab34 介导的溶酶体聚集于细胞核周围，进而溶酶体和吞噬体融合减少，导致吞噬体抗原降解减少而促进交叉提呈的进行。SAMIE 等［15］也发现，TFEB作为分子开关，与其相互作用蛋白互作后，调控溶酶体酶活性和吞噬体内pH 值而调节DCs 的交叉提呈过程。DINGJAN 等［16］对VAMP8 的类似操作也通过影响吞噬体和内体的酸碱度调节DCs的交叉提呈过程。因此，吞噬体内的酸碱度、吞噬体与溶酶体的融合速度是调控DCs交叉提呈的首要步骤。

2 内质网与吞噬体相互联系对交叉提呈的影响

DCs 的吞噬体中有大量内质网蛋白的驻留，如MHCⅠ、TAP、Sec61、钙网蛋白、钙连蛋白等，提示内质网与吞噬体间有广泛紧密的相互联系［7］。CEBRIAN等［17］研究发现，SNARE家族中Sec22b定位于内质网高尔基体中间器室（ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC），并负责招募内质网驻留蛋白至吞噬体中，通过用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低Sec22b 的表达，发现Sec22b 的沉默可导致内质网驻留蛋白转位至吞噬体减少，继而导致抗原由吞噬体进入细胞质减少，并伴随滞留于吞噬体的抗原降解增加，而最终降低DCs 的交叉提呈。ALLOATTI 等［18］研究发现，Sec22b 敲除的小鼠个体，其体内骨髓来源的DCs（bone marrow derived DCs，BMDC）及脾脏DCs 对抗原的交叉提呈减少并导致肿瘤易感性。WU 等［19］的实验虽发现Sec22b敲除对小鼠的抗原交叉提呈能力没有影响，但以shRNA 技术对DCs的敲减却明显影响交叉提呈。其后续实验发现，基因敲除小鼠与敲减细胞实验截然不同的结论归因于基因敲除的脱靶效应。ALLOATTI 等［18］和WU 等［19］的研究也证明：介导内质网与吞噬体交互运输的Sec22b 蛋白与DCs 的交叉提呈直接相关，提示内质网驻留蛋白转位于吞噬体是交叉提呈不可或缺的步骤。衣壳蛋白复合物Ⅱ（coat protein complex Ⅱ，COPⅡ）介导MHCⅠ类分子从ER 进入ERGIC［20］。ABE 等［21］发现转运受体Bap31 与MHCⅠ类分子结合并聚集在内质网（endoplasmic reticulum，ER）出口，负载抗原后促进Bap31 及MHCⅠ类分子通过COPⅡ介导囊泡运输从ER 转运到ERGIC，从而增加表面MHCⅠ类分子，而伴侣蛋白Bap29 过表达导致细胞表面MHCⅠ类分子减少，因此伴侣蛋白Bap29 调节Bap31，Bap31 能够促进MHCⅠ类分子的运输至ERGIC。总的来说，ERGIC 涉及内质网驻留蛋白移动至吞噬体及MHCⅠ类分子的运输，影响交叉提呈的发生。

3 受体介导的内吞作用对交叉提呈的影响

DCs 对外源性抗原的摄取主要有吞噬、胞饮和受体介导的内吞3种方式［22］。吞噬是指质膜内陷形成吞噬体（＞250 nm），吞噬体可与内体相互作用，从而启动交叉提呈。胞饮提呈液相的抗原，只有抗原浓度较高时，才能较好地发挥提呈作用［7］。而DCs经受体介导的内吞对可溶性抗原的提呈可在抗原浓度较低时发生，因此，受体介导的内吞是DCs高效提呈抗原的主要方式，这些受体主要包括甘露糖受体（mannose receptor，MR）、DEC-205、Clec9a（DNGR1）等。BURGDORF 等［23］发现，MR 介导的内吞抗原主要靶向早期内体，抗原经蛋白酶体处理成抗原肽后，在内体与MHCⅠ类分子形成复合物，再于细胞表面提呈给CD8+T 细胞；而清道夫受体介导的内吞抗原则主要靶向溶酶体，抗原经溶酶体酶处理后，于内质网与MHCⅡ类分子结合形成复合体，提呈给CD4+T 细胞。即表面受体不同，其所介导的内吞抗原驻留的细胞器、抗原提呈的发生部位、提呈抗原所致敏的CD4+T 细胞或CD8+T 细胞均不同。ZELENAY 等［24］发现，DNGR-1 可促进抗原进入早期内体而促进DCs 的交叉提呈。BOZZACCO 等［25］则发现，相较于MR 或DC-SIGN，在淋巴器官广泛表达的DEC205与HIV的gag p24的融合蛋白所诱导的抗体，在较低剂量的条件下也可促进moDCs 产生明显的交叉提呈。因此，对将外源性抗原靶向早期内体的受体分子的发现和操控，正成为提高DCs 交叉提呈及DCs疫苗的主要策略。

4 内体中抗原移位到细胞质对交叉提呈的影响

在内体-细胞质交叉提呈途径中，内体中内化的抗原自内体转运至细胞质，可促进DCs的交叉提呈，而此过程与细胞的内质网相关降解途径（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）密 切 相关［26］。所谓ERAD是指内质网中驻留的修饰酶将错误折叠的蛋白靶向运输至细胞质，被蛋白酶体降解的过程。ERAD 通路可细分为ERAD-L、ERAD-M、ERAD-C 3 种。其中，ERAD-L 主要涉及由Hrd3p、Usa1p、Der1p、Hrd1p 等组成的泛素化酶Hrd1p 复合物。其主要过程包括Hrd3p 和Der1p 将底物传递给Hrd1p、Usa1p 招 募Der1p 到Hrd1p 形 成 寡 聚 体、Hrd1p使底物复合物结合松散、ATP 复合物对Hrd1p复合物进行变构、底物进入细胞质并Hrd1p泛素化、ATP 酶将复合物靶向蛋白酶体进行降解等步骤，因此，Hrd1p在ERAD-L通路介导的抗原移位中发挥核心作用［27］。ZEHNER等［28］研究发现，干扰Hrd1不仅可导致交叉提呈减少，同时会影响MHCⅡ类途径。除Hrd1p 外，ERAD 的其他成员还包括Sec61、Derlin-1、p97、gp78、CHIP、HERP 等［29］。ZEHNER 等［28］以特异性阻断Sec61转位的捕获抗体为工具，发现TIR结构域衔接蛋白（TRIF）可介导Sec61自内质网转位于内体，且Sec61 而非Derlin-1 转位是内体抗原移位至细胞质的关键。MÉNAGER等［30］以人工合成的Melan-A的长肽（第16～40 位肽段）为模式抗原，发现moDCs对该长肽的交叉提呈依赖于p97内体转位。ZEHNER等［31］的后续研究则发现肿瘤易感因子101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）可负性调控MR 的K48泛素化，p97内体转位减少导致抗原移位到胞质减少，降低DCs 的交叉提呈能力。因此，ERAD 成员蛋白p97、Hrd1p 介导内体抗原到细胞质的移位，Sec61 则介导内质网驻留蛋白转位到内体，二者协同促进DCs 对外源性抗原的交叉提呈。因此，以适应性免疫应答为基础的DC 疫苗首先应聚焦于p97、Hrd1p、Sec61等靶分子，至于其他ERAD成员蛋白是否具有类似功能，尚待进一步研究。

5 蛋白酶体降解抗原对交叉提呈的影响

移位进入细胞质的DCs 被蛋白酶体加工处理，该过程与泛素化密切相关［32］。泛素由76 个氨基酸组成，一个完整的泛素化过程需由泛素活化酶E1、结合酶E2 及连接酶E3 共同完成［33］。活化酶E1 在ATP 催化下，将泛素的羧基端与半胱氨酸形成硫酯键，在结合酶E2作用下，活化的泛素与结合酶E2半胱氨酸残基结合，再由连接酶E3催化泛素分子羧基结合到靶蛋白赖氨酸侧链上［34-35］。泛素有7 个赖氨酸（lysine，K）残基，因此，蛋白的泛素化也可根据其发生泛素化的赖氨酸位置而分为K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63等方式的泛素化［36］。YOU等［37］以泛素化抑制剂PYR-41 或沙度利胺（Thalidomide）抑制NF-κB 通路泛素化所致的激活，观察到内体对p97 及Sec61 的招募减少并致内化抗原的细胞质移位降低，从而损害DCs 的交叉提呈。SONG 等［38］以病毒侵染巨噬细胞，发现RNF128 经TBK1 发生K63泛素化而活化IFN- β 通路来发挥抗病毒作用。ZEHNER 等［31］利用表达MR K48 泛素化的突变体的DCs，发现MR 的K48 泛素化可明显促进DCs 对抗原的交叉提呈，而TSG101 则负性调控该交叉提呈过程。上述研究提示，DCs 表面受体的泛素化方式决定了内吞抗原的亚细胞定位及蛋白降解途径。MR及其他受体的泛素化方式对细胞交叉提呈能力的影响有待于进一步研究。

6 抗原肽装载至MHCⅠ类分子对交叉提呈的影响

DCs交叉提呈中所内吞的抗原被蛋白酶体降解后，仍保留存在较长的肽段。只有经胰岛素调节氨肽酶（insulin-regulated aminopeptidase，IRAP）或内质网 氨 肽 酶（endoplasmic reticulum aminopeptidase，ERAP）剪切的短肽，才能装载于MHCⅠ类分子抗原肽结合沟槽［39］。因此，合适长度的抗原短肽及MHCⅠ类分子的数量也决定了DCs 的交叉提呈。一般而言，MHCⅠ类分子主要有来源于细胞表面、自内体器室循环到吞噬体和经内质网进入到内体器区室3种来源［7］。BASHA等［40］通过调控MHCⅠ类分子胞质段酪氨酸活性而调节其自胞膜向胞内的运输，发现来自细胞表面的MHCⅠ类分子影响DCs 的交叉提呈。NAIR-GUPTA 等［41］研究发现，SNAP-23 磷酸化可增加Rab11a 介导的MHCⅠ类分子自循环内体转位到吞噬体而促进交叉提呈。MONTEALEGRE等［42］也发现，内体器室及细胞表面GTP 酶Arf6 可通过影响MHCⅠ类分子与Rab11a+内体的共定位而调节DCs 对Fc 受体介导的抗原提呈。以Brefeldin A（BFA）阻断MHCⅠ类分子自内质网转运至高尔基体，或抑制目的分子CD74 从而抑制MHCⅠ类分子自内质网移位至内体中发现，将MHCⅠ类分子滞留于内质网可明显抑制交叉提呈［43-44］。上述研究均提示，内体中MHCⅠ类分子的数量也是DCs 交叉提呈能力的决定因素。

7 结语与展望

近年来，国内外对DCs 交叉提呈的机制已有报道。但涉及交叉提呈的深层次问题，如液泡途径和内体-细胞质途径的准确界定、可溶性抗原或颗粒性抗原的机制区别、泛素化方式对抗原亚细胞定位的影响、抗原在胞内的移位过程及机制、MHCⅠ类分子的移位及转运等，均需要新的探索。此类探索不仅可认识DCs 新的生物学特性，也为设计基于适应性免疫应答的DCs 疫苗提供新的靶点，为维护人类健康做出新的免疫学贡献。