组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966改善放射性脑损伤的研究

任安邦 李荣 徐安安 简海锋 李可俊 袁亚维

广州医科大学附属肿瘤医院放疗科（广州510095）

头颈部原发肿瘤及转移瘤每年新增确诊病例数超过500 000 例［1］，放射治疗是其最有效的非手术治疗方式［2］。头颈部肿瘤患者放射治疗后产生一系列中枢神经系统损害的症状称为放射性脑损伤（radiation-induced brain injury，RBI），近年来放射性脑损伤确诊率总体呈上升趋势［3］。放射性脑损伤是一个渐进的过程［4］，后期出现的不可逆性认知功能障碍严重影响肿瘤患者的生活质量［5］。类固醇［6］、贝伐单抗［7］等药物临床治疗放射性脑损伤效果非常有限，除此之外目前尚无其他有效的放射性脑损伤治疗方法。小胶质细胞是大脑主要的免疫细胞以及神经炎症的关键介质细胞［8-10］，而神经炎症在放射性脑损伤的发展中起关键作用［11］，认知功能损伤往往也与神经元凋亡相关［12］。因此，如何有效减少小胶质细胞炎症反应和神经元凋亡对于改善放射性脑损伤至关重要。

HDAC3 是大脑中表达最多的一种组蛋白去乙酰化酶［13］，负向调控大脑学习和记忆过程［14］。HDAC 抑制剂是一类有干扰HDAC 功能的化合物，RGFP966 为高度选择性的HDAC3 抑制剂。RGFP-966 具有神经炎症抑制效应，可保护脊髓损伤［15］。既往研究发现Ⅰ类HDAC 抑制剂（丙戊酸钠）可以保护放射性脑损伤［16］，而HDAC3属于Ⅰ类HDAC［17］，故本实验以HDAC3 抑制剂RGFP966 为干预药物，以放射性脑损伤为研究病种，脑内小胶质细胞的炎症水平和神经元的凋亡变化为指标，初步探索RGFP966 是否可改善放射性神经炎症，为放射性脑损伤保护提供全新视角。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂RGFP966（A8803，美国APE×BIO 公司）；TNF-α、IL-6 和IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（HZ-1014、HZ-1019、HZ-1164，美国Proteintech公司）；TUNEL 试剂盒（G3250，Promega 公司）；实验所用肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列（5′-3′）：TNF-α-F：GGAACACGTCGTGGGATAATG；TNF-α-R：GGCAGACTTTGGATGCTTCTT；IL-6-F：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG；IL-6-R：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；IL-1β-F：TTCAGGCAGGCAGTATCACTC；IL-1β-R：GAAGGTCCACGGGAAAGACAC；β-actin-F：TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC；β-actin-R：GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC。

1.2 注射药液的制备RGFP966 溶于二甲基亚砜（DMSO），但由于DMSO 本身对动物有刺激作用，因此将RGFP966 溶解在DMSO 同时并在30%（wt/vol）羟丙基-β-环糊精和100 mmol/L 乙酸钠（pH 5.4）的载体中稀释，最终掺有药物和媒介物的DMSO 浓度为10%（vol/vol）。羟丙基-β-环糊精对肌肉没有刺激性，是一种理想的注射增溶剂和药物赋形剂。所用动物给药的浓度为10 mg/kg，细胞培养用的浓度为10 μmol/L。

1.3 动物分组将40 只C57BL/6 小鼠饲养1 周适应环境后将其按照有无放射和有无注射抑制剂随机分为4组：A，溶剂对照组；B，放射组；C，RGFP966组；D，放射+RGFP966 组，每组10 只。

1.4 放射性脑损伤模型的建立动物模型：根据已有参考文献的模型复制，具体方法如下：小鼠腹腔注射5%的水合氯醛（0.2 mL/20 g），待其静止后俯卧位固定于治疗床上。为更加贴合临床实际，将用直线加速器（型号：Clinic iX，Varian，Pali Alto，CA，USA）剂量率300 cGy/min、源轴距（SAD）为1.5 cm的6 MV 光子线，照射野大小2.5 cm × 3 cm 剂量为30 Gy 单次照射小鼠全脑。通过前期实验验证照射后一周内小鼠自主活动量逐渐减少，包括头部皮肤在内的照射野开始出现轻度脱毛，切片染色观察到脑内出现神经元凋亡，指示放射性脑损伤模型建立成功。

1.5 动物给药方案放射前1 天按照分组情况将小鼠分别预先皮下注射10 mL/kg 的配置好的不同药物，放射当天在放射前一小时分别以同样的方式第二次给药，再以直线加速器进行全脑放射，继而在放射后第一天和第二天连续皮下注射两天，观察小鼠脑内的小胶质细胞激活和神经元凋亡情况。

1.6 样本采集动物脑组织：末次给药后24 h内取样。（1）分别对各组小鼠进行称重并记录，予质量分数1%的戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉（50 mg/kg）；（2）迅速打开腹腔，用PBS 和4%的多聚甲醛进行心脏灌注；（3）用眼科剪剪开小鼠颅骨速取大脑，置于质量分数4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h。细胞RNA：1 mL Trizol 裂解细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA。无DNA/RNAse 水溶解稀释RNA，紫外分光光度计测量RNA 浓度。按照cDNA 反转录试剂盒（TaKaRa）操作使用说明书，反转录RNA为cDNA。

1.7 指标检测

1.7.1 脑组织的病理变化组织免疫荧光验证取出固定24 h 后的脑组织再经脱水、石蜡包埋及切片后，根据TUNEL 试剂盒步骤要求组织染色，荧光显微镜观察其形态变化。

1.7.2 小胶质细胞的炎症水平qRT-PCR 验证：采用TB Green®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒，qRT-PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司，CFX96）扩增cDNA，β-肌动蛋白作为内参基因，2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。酶联免疫吸附法（Elisa）验证：将目的时间段的细胞培养基收集离心，按照试剂盒要求在酶标仪下450 nm 波长处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

1.7.3 CCK-8 验证细胞增殖活力将消化下来的细胞悬液每孔按照103/100 μL 数量滴加入96 孔板中，按照试剂盒说明不同时间段在酶标仪450 nm波长处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

1.8 统计学方法实验数据采用GraphPad Prism 7、SPSS 15.0 软件进行处理，所得结果均以均数±标准差表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGFP966抑制放射后的小胶质细胞激活小胶质细胞的激活往往出现在损伤早期，IBA-1 是小胶质细胞激活的标记物。30 Gy放射24 h后分别检测小鼠小胶质细胞的激活以及细胞活力情况，结果显示照射后加入RGFP966 的BV2 细胞胞体有所减小，阿米巴样改变缓解，IBA-1 表达也有所减少（图1A），脑组织石蜡切片观察到放射+RGFP966组的小胶质细胞胞体相较于单纯放射组明显缩小（图1C）；CCK-8 检测表明放射+RGFP966 处理组的BV2细胞活力显著高于单纯放射组（图1B）。

图1 小胶质细胞IBA-1 的表达情况（免疫荧光染色，×200）及细胞活力变化Fig.1 Expression of IBA-1 in microglia（IF，×200）and changes in cell viability

2.2 RGFP966 抑制放射后的小胶质细胞炎症因子表达和分泌TNF-α、IL-6、IL-1β是小胶质细胞放射激活后表达和分泌的经典急性炎症因子，通常在放射后6 h 即在小胶质细胞的培养上清中显著升高。qPCR检测发现，加入RGFP966的30 Gy放射组小胶质细胞的以上三种炎症因子mRNA 水平显著低于单独30 Gy 放射组细胞（表1）；利用Elisa 方法检测显示，加入RGFP966 的放射组小胶质细胞培养基上清中的炎症因子含量显著低于单独放射组细胞（表2）。

2.3 RGFP966 抑制放射后的神经元凋亡30 Gy放射72 h 后分别检测海马神经元的凋亡比例及活力情况，将神经元HT22 细胞进行TUNEL 染色并计数，显示放射+RGFP966 组中细胞凋亡的数量相较于单独放射组明显减少（P＜0.05，图2A），脑组织石蜡切片TUNEL 染色显示放射+RGFP966 组海马区齿状回（dentate gyrus）的凋亡细胞数量相较于单纯放射组明显减少（P＜0.05，图3）；CCK8 实验检测发现，在放射30 Gy 后24 和72 h 的放射+RGFP966 处理组的HT22 细胞活力显著高于单纯放射组（图2B）。

3 讨论

头颈部肿瘤患者在进行放射治疗的过程中，肿瘤细胞会连同周边人体正常组织细胞一同接受放射［18］，因此放疗也可能对邻近的正常脑组织造成伤害并导致神经系统并发症［19］。有关放射性脑损伤发生的机制目前仍不明确，多项研究认为小胶质细胞介导的神经炎症和神经元凋亡起重要作用［20］。HDAC3是一种重要的基因表达调节蛋白［21］，抑制HDAC3 的表达可改善多种神经系统疾病动物模型的严重程度。

本实验结果显示，RGFP966 处理可以显著抑制BV2 细胞的放射后激活，并降低BV2 细胞在放射后急性期炎症因子的表达水平及其在细胞上清液中的含量，表明该抑制剂可能通过影响小胶质细胞中的某些炎症通路来减少放射激活过程中产生的炎症因子。在脑组织功能分区中，海马区是负责学习和记忆的关键区域，小鼠海马区神经元凋亡使小鼠出现学习和记忆能力的下降［22］。已有研究证明长期给予RGFP966 可以增强小鼠的长期记忆、空间和识别记忆［23-24］。依据上述理论，本研究采取30 Gy 剂量单次全脑放射小鼠，TUNEL 染色法观察小鼠海马区齿状回神经元凋亡情况，注射RGFP966 抑制剂的小鼠海马区神经元凋亡数量较之单纯放射处理组明显减少，结果提示放射会导致小鼠海马区细胞凋亡，RGFP966 可以一定程度上改善凋亡状况，间接为小鼠的空间学习和记忆能力的保护提供了理论依据。有研究表明可能是通过激活转录因子Nrf2，从而进一步活化其下游的细胞保护性因子GSH、SOD 等［25］，但下调的HDAC3 具体是通过何种途径改变凋亡信号通路仍需笔者进一步探究。

表1 炎症因子mRNA 表达情况Tab.1 mRNA expression of inflammatory factors ±s

表1 炎症因子mRNA 表达情况Tab.1 mRNA expression of inflammatory factors ±s

注：取溶剂对照组6 h 为参照，#表示未放射组间P 值；*表示放射组间P 值

基因TNF-α IL-6 IL-1β时间（h）6 12 24 6 12 24 6 12 24溶剂对照组1 1.27±0.19 1.26±0.18 1 1.19±0.17 1.17±0.12 1 1.24±0.13 1.21±0.22放射组4.74±0.62 1.45±0.28 1.51±0.21 1.35±0.21 1.53±0.18 2.06±0.19 2.41±0.20 1.67±0.17 1.24±0.16 RGFP966组1.13±0.15 1.30±0.24 1.19±0.13 1.17±0.11 1.14±0.20 1.15±0.13 1.11±0.10 1.25±0.19 1.37±0.08放射+RGFP966组2.24±0.31 1.77±0.17 1.25±0.14 1.24±0.15 1.22±0.23 1.41±0.24 1.54±0.13 1.24±0.07 1.15±0.06 P值#0.522 0.879 0.723 0.160 0.679 0.762 0.339 0.909 0.190 P值*＜0.001 0.839 0.200 0.353 0.014＜0.001＜0.001 0.001 0.446

表2 炎症因子浓度差异Tab.2 Difference in inflammatory factor concentration ±s，pg/mL

表2 炎症因子浓度差异Tab.2 Difference in inflammatory factor concentration ±s，pg/mL

注：取溶剂对照组6 h 为参照，#表示未放射组间P 值；*表示放射组间P 值

基因TNF-α IL-6 IL-1β时间（h）6 12 24 6 12 24 6 12 24 6 12溶剂对照组1 1.27±0.19 1.26±0.18 1 1.19±0.17 1.17±0.12 1 1.24±0.13 1.21±0.22 1 1.27±0.19放射组4.74±0.62 1.45±0.28 1.51±0.21 1.35±0.21 1.53±0.18 2.06±0.19 2.41±0.20 1.67±0.17 1.24±0.16 4.74±0.62 1.45±0.28 RGFP966组1.13±0.15 1.30±0.24 1images/BZ_18_1224_1601_1418_1716.png1 1.14±0.20 1.15±0.13 1.11±0.10 1.25±0.19 1.37±0.08 1.13±0.15 1.30±0.24放射+RGFP966组2.24±0.31 1.77±0.17 1.25±0.14 1.24±0.15 1.22±0.23 1.41±0.24 1.54±0.13 1.24±0.07 1.15±0.06 2.24±0.31 1.77±0.17 P值#0.522 0.879 0.723 0.160 0.679 0.762 0.339 0.909 0.190 0.522 0.879 P值*＜0.001 0.839 0.200 0.353 0.014＜0.001＜0.001 0.001 0.446＜0.001 0.839

在临床研究和FDA 批准的用药通常是泛抑制低选择性的HDAC 抑制剂，尽管低选择性HDACI在临床前或临床研究中表现出高活性，但其所引起的副作用包括胃肠道恶心、血液系统血小板减少症、中性粒细胞减少和贫血、代谢性肝毒性、电解质失衡和肾功能不全等令人担忧［26］，因此为降低上述毒副作用本研究选用RGFP966，它是一种高度选择的特异性抑制HDAC3 活性的新型化合物。放射性脑损伤涉及多种细胞功能异常，本研究表明该药物具有保护神经元，抑制炎症，保护血脑屏障等多重效应，有临床应用潜力。但作为探索药物保护效应的初步研究，本研究并没有做相关行为学，无法确定该药物是否能改善动物的整体认知能力。因此笔者下一步的研究方向将就该药物对动物认知能力的影响进行具体的验证，并探索其在神经元和小胶质细胞，血脑屏障的详细作用机制。

图2 小鼠HT22 细胞的凋亡（TUNEL，×100）及细胞活力变化Fig.2 Changes of apoptosis（TUNEL，×100）and cell viability in mouse HT22 cells

图3 小鼠脑组织海马区凋亡变化（免疫荧光染色，×100）Fig.3 Apoptotic changes in hippocampus of mouse brain（IF，×100）

总之，笔者对于选择性HDAC3抑制剂RGFP966应用于放射性脑损伤的效果进行了初步的探索，它能够减轻放射脑损伤急性期的炎症水平，减少神经元凋亡，为临床增加放射性脑损伤保护的新途径提供可能。