多功能纳米粒干预肿瘤细胞膜转运蛋白相关性耐药的研究进展

江唯希，任建丽

1重庆医科大学超声影像学研究所超声分子影像重庆市重点实验室，重庆 4000162重庆医科大学附属第二医院超声科，重庆 400016

先天性或获得性肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)已经成为肿瘤对化疗药物不敏感以及肿瘤复发或转移的最主要原因之一[1-2]。肿瘤MDR的形成受多种机制介导，目前与MDR相关且研究较为深入的机制主要有：ATP结合盒转运蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC)，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)及多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)过度表达导致药物外排[3]；肿瘤内乏氧、偏酸以及高浓度谷胱甘肽的微环境对化疗药物的解毒作用[4- 5]；耐药细胞激活DNA自我修复、抗凋亡等程序[6- 7]；上皮-间质细胞转化[8]等。由多药耐药基因1(multidrug resistance 1 gene，MDR1)编码的P-gp可在乳腺癌、肺癌、膀胱癌[9- 11]等多种耐药肿瘤细胞膜表面高度表达，已被证实是肿瘤耐药性形成的最重要机制之一。通过与化疗药物多位点结合，P-gp以外排“泵”的形式将药物排出细胞外，从而降低抗肿瘤药物对肿瘤细胞的抑制作用[12]。除P-gp外，目前还发现另外几种耐药蛋白，如肿瘤MRP1、乳腺癌耐药蛋白、肺耐药相关蛋白(lung-resistance protein，LRP)等也与MDR的形成有密切关系[13- 14]。近年来，以多功能纳米粒为载体的药物递送系统因其高度生物相容性、靶向性以及智能响应性等优点，相继进入研究者视野。采取合理设计构建的多功能纳米粒，可通过不同途径抑制或干预细胞膜表面的ABC相关转运蛋白对药物外排作用，有助于逆转MDR和提升化疗药物对肿瘤的敏感性[15-16]。本文主要对多功能纳米粒通过干预细胞膜转运蛋白实现逆转MDR方面的研究做一综述。

药物共递送策略

多功能纳米粒往往因其具有能够同时包载两种或两种以上不同极性或不同尺寸的药物的特性，深受研究者青睐。有学者通过设计纳米共递送系统，除输送传统化疗药物外，同时递送一到两种膜转运蛋白相关抑制剂达到干扰细胞膜转运蛋白外排药物的目的，借此对抗肿瘤MDR。

MDR逆转剂MDR逆转剂可以通过与药物底物竞争性结合P-gp位点降低抗肿瘤药物的外排作用[17-18]。使用多功能纳米粒同时负载抗肿瘤药物及MDR逆转剂，可作为克服MDR的手段之一。以维拉帕米为代表的钙离子通道阻滞剂在临床中常运用于治疗心律失常。与此同时，维拉帕米还可作为药物竞争底物与P-gp结合使其对抗肿瘤药物的外排减少。然而，这类逆转剂往往会因为抑制转运蛋白所需要的剂量过高(2～6 μmol/L)引发心脏毒性[9]。Wang等[19]将聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)修饰的脂质体作为纳米载体共同递送维拉帕米和化疗药阿霉素(doxorubicin，DOX)，不仅证实DOX在维拉帕米的协同效应下对耐药细胞的细胞毒性明显增强，而且发现纳米粒对药物的缓释效应降低了维拉帕米对心脏的毒副作用。Yang等[20]采取与Wang等[19]类似的方法逆转MDR，他们选择FG02032作为MDR逆转剂并报道一种具有高度生物相容性的叶酸修饰聚环氧乙烷-聚ε已内酯[folate-polyethyleneglyco-poly(ε-caprolactone-co-L-lactide)，folate-PEG-PCL]纳米胶束用于递送FG020326，并采用纳米胶束和长春新碱(vincristine，VCR)对KBv200/VCR细胞株进行序贯给药，结果显示在叶酸靶向和FG020326介导MDR逆转的作用下，VCR对细胞株的半抑制浓度由合并纳米胶束前的0.3160 μmol/L降至0.0046 μmol/L，证明靶向型载MDR逆转剂多功能纳米粒可以提高化疗药对耐药细胞的敏感。有研究认为化疗药物可以与通过凋亡信号分子神经酰胺(ceramide，CER)联合，从而促进细胞凋亡达到下调ABCD1转运蛋白的目的[21]。 Devalapally 等[21]将CER和紫杉醇(paclitaxel，PTX)共同包封在PEG-PCL纳米粒中，通过对卵巢癌野生型SKOV- 3和耐药型SKOV- 3TR细胞株皮下移植瘤模型采用该纳米粒治疗后发现，载CER和PTX纳米粒对SKOV- 3以及SKOV- 3TR肿瘤生长抑制效率分别是对照组的4.3和3.0 倍；药效动力学结果显示，递送PTX的纳米粒对肿瘤的抑制时间可由单独使用PTX的6.6 d延长至12.3 d，证明该方法能有效增强化疗药物对肿瘤的治疗作用，抑制肿瘤生长。姜黄素(curcumin，CUR)是一种由植物根茎中提取的二酮类化合物。有研究表明CUR可以抑制3种主要的耐药相关蛋白(P-gp、 MRP1、ABCG2)达到逆转MDR的作用。Lv等[22]将人工合成的载双药双嵌段纳米胶束(CUR/DOX)与人乳腺癌MCF7- 7/ADR耐药株共孵育48 h，结果显示该细胞株中P-gp的表达得到显著下调，ATP水解是细胞膜转运蛋白能量的主要来源，该研究显示采用CUR/DOX胶束可使细胞内ATP水解减少45%，而单纯DOX组仅减少9%，表明CUR介导的外排泵的下调可能与阻断ATP水解供能有关。随着对肿瘤耐药机制研究的逐渐深入，目前以代司朴达(PSC833)、比立考达(VX- 710)为代表的第二代MDR逆转剂已经研发完成，在具备与细胞膜转运蛋白更高亲和力的同时也降低了药物的毒副作用。此外，第三代MDR逆转剂也已经进入Ⅲ期临床实验。据报道，该类逆转剂可以避免影响其他ABC相关转运蛋白的功能，效果更优于前两代[23]。

小干扰RNAMDR1是最早被发现的多药耐药基因，可在多种正常组织中表达。研究表明MDR1编码的P-gp通过转运和分泌功能使正常组织细胞免受细胞毒素及外源性有毒物质的影响[24]。然而，目前对于MDR1调控机制的研究尚未完全清晰，另外，P-gp的翻译及翻译后水平也可能同时受到多方面的影响。基因沉默效应能够干预耐药癌细胞株中特异基因的表达，近年已经被广泛运用于逆转MDR的治疗中。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为基因沉默的效应分子，可通过下调耐药基因的转录抑制细胞中P-gp活性，从而恢复耐药细胞对化疗药物的敏感度。Zhang等[25]研发了由壳聚糖-聚赖氨酸-软脂酸组成的三嵌段胶束(N-succinyl-chitosan-poly-l-lysine-palmitic acid，NSC-PLL-PA)，利用静电吸附作用将呈负电荷的siRNA吸附在阳离子聚合物PLL表面，同时利用NSC避免纳米粒被网状内皮系统快速清除，延长纳米给药系统在血液循环中的时间；此外，该胶束还具有良好的pH响应性。在弱酸性环境下(pH 5.3)，NSC-PLL-PA能够加速DOX和siRNA的释放；Western blot结果显示，随着胶束中siRNA浓度的升高，细胞内的mRNA水平降低，P-gp表达下降。Sun等[26]同样试图以共递送siRNA以及化疗药方式实现MDR的逆转。然而值得注意的是，大分子的siRNA往往因为被修饰在纳米粒表面而直接暴露于细胞内RNA酶的降解作用中，致使其活性下降。而该团队利用有机硅纳米粒(hierarchical mesoporous silica nanosystem-DOX/siRNA，H-MSNs-DOX/siRNA)表面大尺寸的介孔以及内部的核结构，分别对大分子siRNA和小分子DOX进行封装以此保护其分子活性，在肿瘤微环境内高浓度谷胱甘肽的作用下，纳米外壳表面的二硫键遭到破坏，首先释放的siRNA能够下调P-gp的表达，防止药物外排，使二阶段释放的小分子化疗药物更好地发挥抗肿瘤作用，结果显示与对照组相比，经siRNA处理后的人乳腺癌耐药细胞株MCF- 7/ADR中P-gp 的表达下降40%，同时裸鼠皮下移植瘤模型也证实，注射H-MSNs-DOX/siRNA后，对小鼠肿瘤抑制率(87.0%)高于单纯DOX溶液组(50.7%)。有研究人员制备了载多柔比星和Bcl- 2靶向siRNA(Bcl- 2 siRNA)的介孔二氧化硅纳米粒，实验结果表明，Bcl- 2 siRNA不仅可以通过沉默mRNA降低细胞膜转运蛋白的表达，同时还能干扰MDR细胞耐药形式中的非泵途径，如Bcl- 2蛋白介导的抗凋亡作用，联合使用BCL- 2 siRNA以及多柔比星的细胞毒性是使用多柔比星溶液的132倍[27]。多功能量子点纳米材料具有粒径小、易渗透、毒副作用低等优点。Li等[28]采用静电吸附的方式将DOX和siRNA共同负载于量子点周围以逆转宫颈癌细胞Hela的耐药性，实验结果与上述研究一致。利用共递送siRNA和药物的策略，在基因水平改变细胞膜转运蛋白的外泵作用，使其成为一种克服MDR的有效手段，未来可能扮演更重要的角色。

一氧化氮及其供体肿瘤学研究显示，高浓度一氧化氮(nitric oxide，NO)不仅可以抑制肿瘤生长，同时与细胞膜表面受体P-gp的表达也存在着密切相关性[29-30]。有报道称阿霉素对恶性肿瘤的抑制作用可能与NO依赖机制的介导有关，因此化疗联合NO可以起到增敏疗效的作用。Riganti等[31]研究显示，经过人工筛选的结肠癌细胞株HT- 29-dx可高表达P-gp和肿瘤MRP3。NO供体亚硝基铁氢化钠可以使HT- 29-dx中MRP3的酪氨酸亚硝基化导致其构象改变，但这种现象并未在P-gp蛋白中观察到。Chung等[32]将NO供体-二亚乙基三胺二醇二氮烯翁和喜树碱11分别包封入中空聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]的亲水相和疏水相中与共递送，经瘤内注射后，二亚乙基三胺二醇二氮烯翁可在癌细胞弱酸性的内环境中水解生成大量NO，并产生足够的气压可破坏PLGA纳米粒的结构，帮助NO和喜树碱- 11在肿瘤部位精准释放，结果显示PLGA纳米粒可以使P-gp表达下降45%，同时喜树碱- 11的释药率也由中性环境中的13%提高至100%；另一方面，大量生成的NO可以作为超声成像的媒介实时监测肿瘤生长，实现载药纳米粒诊疗一体化的功能。有研究认为肿瘤内部的乏氧环境可通过激活低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)家族，启动下游耐药基因转录并翻译MDR1和P-gp，将药物泵出细胞[33-34]。Callapina等[35]认为NO可通过恢复脯氨酰羟化酶在乏氧环境中的活性，减少HIF- 1α在肿瘤细胞中内源性积累；另外，NO还可以通过抑制HIF- 1α的C端反式激活结构域，阻断其与DNA的结合，防止HIF转录，达到逆转MDR的目的。陈敏等[36]认为NO可能是通过抑制核因子κB通路而影响P-gp的过度表达。尽管已有大量研究证明NO可以通过下调P-gp表达恢复肿瘤对药物的敏感，但关于NO影响这一类型转运蛋白的相关机制和信号通路的解释尚无定论，仍需进一步探讨。使用载NO或NO供体纳米粒干预肿瘤细胞膜转运蛋白功能和克服多药耐药性可能涉及多方面途径。

外界响应策略

多功能纳米粒的外界响应性是指通过外加磁场、激光、超声等外部刺激调控药物的释放、聚集或者发生化学反应，在提高治疗效果的同时降低毒副作用。外界响应性纳米粒联合化疗的治疗策略对于克服MDR具有良好的前景[37]。

激光响应近红外激光具有穿透组织能力强、安全性高的优点。Dong等[38]利用二硫化钼(molybdenum disulfide，MoS2)粒度细以及光热转化效能高等特性，设计了一种透明质酸(haluronic acid，HA)修饰的MoS2纳米薄片，期望通过光热-化疗联合治疗逆转MDR，在波长808 nm激光的辐照下，MoS2的温度可在10 min内上升至52 ℃，不仅能够有效杀伤肿瘤细胞，同时可以显著下调细胞膜转运蛋白的表达，荧光寿命成像显示，游离组、MoS2和MoS2-HA组中的阿霉素的荧光分布时间分别为2.2、3.3、4.6 ns，并且与细胞继续孵育12 h后，MoS2-HA组中仍能观察到明显的荧光信号；体内实验观察显示，MoS2-HA+激光组中肿瘤生长抑制率高达96%，较其他各组差异有统计学意义。表明MoS2-HA/DOX能够很好地递送药物和维持细胞内药物浓度，提升光热-化疗联合治疗的效果。Wang等[39]成功构建了一种脂质膜包裹的碳硅杂合纳米粒作为载体搭载化疗药DOX的纳米给药系统，在780 nm激光的辐照下，该纳米系统能够通过靶向线粒体并产生活性氧氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)消耗细胞内的ATP，促使ATP依赖的P-gp蛋白在至少5 d内暂时失去外泵药物的功能，为化疗创造了治疗窗口。该纳米粒的作用同时也在耐紫杉醇、伊立替康两种耐药细胞模型中得到验证，表明这种设计能够有效克服肿瘤的广谱耐药性。

外部磁场响应磁性纳米粒不仅能够作为释药载体，同时也具备磁共振成像功能。Elumalai等[40]设计了多层磁性纳米胶囊以克服转运蛋白的外排，该研究将磁场强度2.0 T，大小1 cm× 1 cm的条形磁铁作为外部磁场放置于细胞培养皿下方，使纳米胶囊能够持续大量聚集在外部磁场放置的部位，在外部磁场作用下，P-gp对药物的外排作用减弱，耐药细胞凋亡率(87.78%)显著上升，基于顺铂的联合化疗是治疗非小细胞肺癌的常用手段。然而有报道指出，耐药型肺癌细胞株A549/DPP中肺LRP的上调可能会致使其对化疗不敏感[41]。有学者合成了载顺铂磁性四氧化三铁纳米粒，研究显示A549细胞中的LRP活性在与载顺铂磁性四氧化三铁/顺铂共孵育48 h后明显下降，磷酸化蛋白激酶Akt的活性也同时降低，肿瘤抑制程度高于游离顺铂组和对照组[42]。因此，该研究推测Akt通路关联的LRP高表达可能是形成MDR的原因之一。

靶点修饰策略

使用靶向分子修饰后的纳米载体可以提高纳米给药系统在肿瘤组织、细胞或细胞器内的聚集效率，克服或逆转转运蛋白的外泵作用。细胞穿膜肽是一类由10～30个富含精氨酸或赖氨酸的氨基酸残基组成的短肽，可以在不损伤细胞结构的情况下携带如蛋白、核酸、纳米粒等大分子物质靶向进入细胞内部发挥作用。Pan等[43]使用肽功能化纳米粒协助药物运输，在细胞穿膜肽TAT的介导下，细胞内DOX的浓度曲线下面积由463(h·ng)/ml提高至1183(h·ng)/ml，荧光显示TAT纳米粒能够更多聚集于细胞核内，提示穿膜肽可能是通过促进药物向细胞核内递送，从而避免被细胞膜表面的转运蛋白外泵；该研究也指出，细胞穿膜肽并不能直接下调P-gp蛋白的表达。转铁蛋白受体在急性髓系白血病细胞表面高度表达。Zhu等[44]将转铁蛋白共价结合到PEG-油酸修饰的纳米材料表面，形成脂质聚合物，证实由转铁蛋白靶向的纳米粒可以增加细胞对药物的吞噬，避免P-gp外排，纳米粒组半抑制浓度(0.7 μg/ml)较单纯化疗组(17.6 μg/ml)下降25倍，表明化疗药的细胞毒性增强。有学者将包载药物的纳米脂质体表面修饰叶酸，发现经叶酸修饰后的化疗药物能够通过叶酸-叶酸受体介导的胞吞形式特异性进入大量表达叶酸受体的肿瘤细胞内，最后经内涵体释放在细胞质及细胞核内，以此避开小分子药物传统的递送模式，不受P-gp泵的影响[45]。然而，也有研究显示，化疗药物接受纳米材料包载后进入细胞有可能是借助细胞与纳米粒的相互作用，而不是以胞吞的方式介导[46]。

其他策略

除上述手段外，经过合理设计构建的多功能纳米粒还可以通过其他途径克服细胞膜转运蛋白相关的耐药作用。Feng等[47]通过一步法合成了双亲性聚合物聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯[poly(ethylene glycol)-poly(2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate)，PEG-b-PDPA]，利用PDPA在低pH中的质子化作用，使纳米胶束在肿瘤的弱酸环境下实现“溶酶体逃逸”，不仅能够减轻细胞膜转运蛋白对抗肿瘤药物的外排，而且也降低了溶酶体内水解酶对药物活性的影响；该研究同时认为，在纳米胶束中加入PLGA可以增加其材料的硬度，有助于提高细胞吞噬效率，研究结果显示，采用该纳米材料递送DOX后，细胞对药物的排出率由单独使用DOX组中的80%减少至低于20%，对药物高效的积累将有助于其发挥抗肿瘤效果逆转MDR。Sun等[48]采用另外的策略克服MDR，将直径约30 nm的金纳米棒利用腙键连接化疗药物，协同下调ATP结合盒转运蛋白B族在MDA-MB- 231肿瘤球中的表达，共聚焦荧光显微镜观察显示，经金纳米棒连接后，DOX与细胞膜表面的转运蛋白结合减少，并向细胞质内部富集，而单纯化疗药组中的荧光则大部分位于细胞膜表面与P-gp结合。此外，有报道称，在聚合物中加入表面修饰活性剂，可以破坏细胞膜亲脂性环境，使细胞膜转运蛋白的二级结构与三级结构的构象发生改变从而有效逆转肿瘤多药耐药性[49]。然而，这种方法目前尚未得到体内实验的证实。

问题与展望

MDR形成的机制非常复杂，其中由细胞膜转运蛋白介导的化疗药物外泵是目前研究的热点。近年来，随着对P-gp、MRP1等耐药相关蛋白研究的深入，通过干预细胞膜转运蛋白功能的方式逆转MDR已取得令人鼓舞的成果。由纳米载体携带药物介导的抗肿瘤治疗已经呈现出众多优势，既能够极大程度上克服传统递送药物的缺点，并且可以联合不同MDR逆转策略协同化疗提高疗效。然而，在实际应用中也存在以下问题：第一，虽然MDR逆转剂的开发已经日趋完善，但P-gp及其他相关转运蛋白除存在于肿瘤细胞外，也广泛分布于正常细胞，因此，在抑制抗肿瘤药物外排以及维持机体稳态找到平衡是运用MDR逆转剂的关键；第二，药物递送过程中往往存在增敏剂性质不稳定、难以在纳米系统中长时间储存等问题。如何有效保持纳米粒子中药物的活性并高效向目标区域释放尚需深入研究；第三，上述研究大多处于体外实验阶段，仍需要大量体内实验以及Ⅱ、Ⅲ期临床实验证明其有效性和可重复性[23，50-51]。相信随着多功能纳米平台的深入开发，未来可以为解决上述问题提供新的契机。