mNGS在肺部感染中的诊断标准及标本选择研究进展

吴 娜 李永霞

1. mNGS概况

1.1 mNGS发展史 宏基因二代测序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)也叫作高通量测序。宏基因组是指生物环境中全部微小生物遗传物质的总和，它包含了可培养和未可培养的微生物基因(包括细菌、病毒、真菌及其他病原体)。二代测序是相较于一代测序(Sanger测序)而言的，20世纪70年代Sanger利用双脱氧链终止法测序技术首次测定了噬菌体X174的基因组序列，全长5375个碱基，后来将这种方法称为Sanger法，这标志着人类基因时代开始[1]。一代测序准确性高，设备运行时间短，但是每次反应只能得到一条序列，测序通量较低，耗费成本高，不能满足人类对庞大基因库的测序需求。2001年在Sanger法的基础上加以改进完成了第一个人体全基因组测序。随着基因技术的发展，宏基因二代测序应运而生，即mNGS。mNGS是利用通量较高的二代测序技术对送检样本宏基因组独立或并行进行测序。它能够测序出临床样本中几乎所有人类已知的病原微生物基因，因此测序深度大，覆盖面广，且2000年后mNGS成本下降了近5万倍，目前一次测序3000余人民币便可完成，并且测序数据量增加1000倍左右[2]，运行效率高，这推动了其在医学领域的广泛利用。

1.2 mNGS用于病原学诊断 2008年和2011年，Palacios等[3]与Xu等[4]分别采用宏基因组及宏转录组发现了两个临床感染病例的新发病原体，分别为沙粒病毒和新型布尼亚病毒，开启了宏基因组学测序(mNGS)技术在感染中应用的先例。首次用于感染病原体诊断是在2014年，一个患有先天性联合免疫缺陷综合征的14岁小男孩在波多黎各旅游回国后反复高热，医生考率为自身免疫性脑炎，便使用糖皮质激素治疗，后男孩的病情恶化，出现了严重的脑积水和无法控制的癫痫发作，并一度陷入昏迷。住院期间(6周内)还应用了38项感染病原体检测，先后更换了5种抗菌药物[5]，小男孩病情均无改善。C.Y.Chiu教授对小男孩的脑脊液做mNGS检测，测序结果表明，大多数序列属于人类，有400多个序列指向钩端螺旋体，便采用大剂量青霉素治疗，小男孩得以成功诊治[6]。Wilson[7]将此病例发表，mNGS成为感染病原体诊断方面的研究热点，后来相继将本方法应用于肺部感染[8]、感染性心内膜炎[9]、感染性胰腺坏死[10]、关节感染[11]等。肺因气体交换直接与外界相通，这种生理学特性决定了肺部感染高发病率。既往认为肺部稳态需要无菌，而健康肺部是有菌的，且菌群随着黏膜摆动和气流而移动[12]。肺部菌群的多样性和多变性也导致肺部感染传统培养方法病原体诊断阳性率低，且上呼吸道感染常常是病毒，病毒变异较快且只能检测已知病毒，mNGS发挥了重要作用[13]。因此，mNGS可以提高肺部感染病原体检出率，特别是对病毒、真菌及特殊病原体更有优势[14，15]。

2. mNGS结果判读标准

目前对于mNGS结果的判读仍缺乏统一标准，阅读Fang X、Chen X、Li Y等人以及现已发表的大量文献[16～21]，将mNGS结果判读总结如下：(1)测序覆盖率排名前10的病原体中，序列数>3。(2)病原体的相对丰度在属水平>30%。(3)传统检测方法与mNGS检测出共同的病原体，且来自该病原体的独特序列片段>50；若序列数<50,但符合临床诊疗也可诊断。(4)细菌、病毒、寄生虫(分枝杆菌、诺卡氏菌除外)检出序列数是相同类型微生物的10倍。(5)病毒比对序列数>100。(6)mNGS检测到的真菌序列数是其余所有真菌的5倍以上。(7)结核分枝杆菌、诺卡菌、嗜肺军团菌序列数≥1。(8)若仅mNGS检测阳性，则该病原体被认为是疑似病原体，需满足以下两点：①文献证实该病原体有肺部致病性；②每百万阅读序列比正常人阴性对照高出2倍。(9)mNGS阴性结果在排外感染性疾病方面具有较高的价值。

总而言之，mNGS结果应以测序深度、序列数量、覆盖度、置信度、相对丰度数值作为参考，临床医生结合患者临床流行病学、病史、体征、实验室检查炎性指标、胸部CT影像学等方面综合判断[21]。

3. mNGS检测肺部感染的标本选择

mNGS的原理是对临床样本中来自人体和微生物的所有核酸序列进行检测，微生物核酸序列占总核酸序列不足5%，且不同临床样本人源性核酸含量不同，单位体积人核酸含量排序为：胸腹水>痰液>血浆>支气管肺泡灌洗液>脑脊液，人源性核酸含量越多，对结果的灵敏度及特异度干扰越大，碱基序列片段的检测敏感度阈值越大[22]。不同类型感染时病原体分布不同，因此每一种临床样本在mNGS检测病原体中各有优势。

3.1 血液 血液标本采集方便，临床中比较容易获得。肺组织血供丰富，肺部感染时病原体及其分解片段可进入血液，从而能够被检测到，当发生菌血症或脓毒血症时，血液检测为最佳标本。血液可避免口腔定植菌的干扰，采集过程中受污染的可能性也较小。尽管血液灵敏度不如肺泡灌洗液，当患者不能耐受支气管镜而无法获得支气管肺泡灌洗液时，血液可作为检测标本。而且重症肺炎常常并发血流感染，Chen J[23]等人将20例重症肺炎患者的血液和BALF同时行mNGS检测发现，有10例患者血液和BALF均为阳性，且血液与BALF中的病原体高度一致，这一结果表明重症肺炎50%可能合并血流感染，此时血液与BALF具有同样的敏感性。

3.2 痰液 肺部感染患者痰培养是一项常规检查，痰液里病原体较多，容易被检出。痰液采集过程及采集方式对结果准确性影响较大，经口咳出痰液最容易获得，对患者无创伤，但痰液经上呼吸道、口腔咳出会带入口腔定植菌，而对于深部肺组织感染代表性较差，从而干扰结果的判读；经吸痰管吸取深部痰，可避免口腔定植菌干扰，但只有气管插管建立人工气道的危重患者才能获得，且吸痰管会损伤患者气道黏膜，加重缺氧或诱发肺不张等。痰液里人源性核酸含量多于血液和BALF，因此若选择痰液送检，结果分析时应综合考虑排除定植菌和污染。然而，痰液检测非结核分枝杆菌优于其他方法，缪青[24]等人研究中，83例痰标本传统培养检出47例，mNGS检出19例，mNGS方法检出例数肺泡灌洗液(33)>肺组织(25)>痰液(19)，由此可得出在非结核分枝杆菌检测中痰培养具有显著优势，当临床怀疑结核或肺结核分枝杆菌感染，可将选择痰液作为标本送检。

3.3 经气管镜获得标本—肺泡灌洗液(BALF)、经支气管镜肺活检组织(TBLB)、支气管针刷标本(BB) 经气管镜可获得BALF、TBLB、BB等标本，这些标本均可大大避免口腔及上呼吸道定植菌的干扰，且防污染支气管肺泡灌洗也减少了污染的机会，因此这些标本均可提高检测结果的准确性。由于支气管镜为侵入性检查，需评估患者的氧饱和度及肺部情况，若不能耐受支气管镜时应选择其他标本进行检测。Wang Q[25]等的一项研究比较了通过mNGS诊断周围肺部感染在经支气管肺活检组织(TBLB)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、支气管针刷标本(BB)、以及TBLB+BALF+BB联合等四种不同标本的诊断效能，结果发现在诊断细菌感染方面，TBLB、BALF、BB以及TBLB+BALF+BB四者敏感性无明显差异；而在诊断真菌感染及未分类病原体感染方面，敏感性TBLB+BALF+BB>BB>BALF>TBLB；TBLB特异性最高，其次是BB、BALF。因此当临床怀疑真菌及不明原因的病原体感染时，可通过支气管镜获取TBLB、BALF、BB进行联合检测，提高病原体检出率。

目前研究中mNGS检测肺部感染绝大多数采用肺泡灌洗液，肺泡灌洗液人源性核酸含量最低，对结果干扰最小，而且样本来自深部肺组织，对深部肺部感染有较好的代表性。大量研究也证实肺泡灌洗液检测效率优于血液和痰液。Chen X[18]等人的研究采用配对设计比较了血液和肺部灌洗液在肺部感染中的诊断效能，结果显示肺泡灌洗液检测灵敏度高于血液(81.3%>25.0%，P=0.003)；而特异度血液略高于肺泡灌洗液(84.6%>76.9%，P=0.317),但差异无统计学意义。综上所述，BALF是肺部感染mNGS检测的最佳标本。

4.局限性与展望

mNGS在病原体检测方面具有其他方法不可比拟的优势，尤其对于混合感染具有绝对优势，但仍然存在一些需改进的问题。第一，mNGS技术本身缺乏行业标准和规范，部分商家受利益驱动缩小测试数据量至1M～5M，从而可能出现结果的假阴性。第二，mNGS技术在文库制备及病原体识别方面缺乏统一、全面、准确的参照数据库，导致不同检测机构的结果可能会有差别，也没有统一的诊断标准。第三，mNGS结果判读缺乏学术界公认的指南或专家共识，临床医生对于结果判读依靠临床经验，有望随着研究的进一步深入，形成统一的标准。第四，标本中人源性背景核酸干扰mNGS结果,去人源化技术有待进一步提高。本文通过对现有的研究进行总结归纳，为临床医生进行mNGS结果判读及标本选择提供参考意见。