流行性出血热主要检测方法比较

宿 放，韩佃刚，杨云庆，杨宏清，尹尚莲，张 冲，王修庚，信吉阁，艾 军

（1.云南农业大学，云南昆明 650201；2.昆明海关，云南昆明 650200；3.梁山县扶贫开发办公室，山东梁山 272600）

流行性出血热（epizootic haemorrhagic disease，EHD）是由呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的流行性出血热病毒（epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，以侵害反刍动物为主的一类虫媒性传染病[1]。EHD 广泛分布于全球的热带与亚热带地区，通过库蠓（culicoides）的吸血性叮咬传播，可感染鹿、牛、羊等多种反刍动物[2]，严重影响畜牧业发展及国际贸易。

目前在世界范围已发现了9 种血清型的EHDV（EHDV-1—EHDV-10），不同血清型病毒间缺乏交叉免疫保护，致病性也存在较大差异，因而给EHD 防控带来了极大挑战[3]。我国主要流行5 种血清型EHDV（EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7 和EHDV-10）[4-5]。不同血清型EHDV毒株间的核酸序列差异可达56.2%，同种血清型不同地域分离毒株的Seg-2核酸序列差异也可达29.4%[6-7]，表明EHDV 血清型具有高度的多样性，因而给牛羊养殖业健康发展构成严重威胁。

近年来，随着国际贸易日趋频繁以及因全球气候变暖导致的虫媒活动范围加大，EHDV 在全球呈现逐步扩散趋势，引起牛发病的报道不断增多。目前，EHD 已被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[8]。检测EHDV 的方法有多种，包括抗原检测和抗体检测，但每种方法各有优劣。本文主要总结抗原检测及抗体检测方法的优缺点，以期为最适检测方法的选择提供参考。

1 抗原检测方法

1.1 病毒分离鉴定

1.1.1 细胞分离培养 从感染动物的血液、死亡动物的组织样本（脾脏、肺和淋巴结）以及库蠓中分离病毒。Aradaib 等[9]将病料接种牛肺动脉内皮、小仓鼠肾（BHK-21）和非洲绿猴肾（Vero）等细胞培养物分离出EHDV，并结合PCR 方法对分离出的病毒进行鉴定，提供了一种快速、灵敏的EHDV 的检测方法。C6/36 和Kc 细胞系也常被用来分离病毒，另外还有鸡胚，但敏感性较低[10]。该方法重复性好，易于人工控制，但有一定危险性。

1.1.2 血清群鉴定

1.1.2.1 免疫荧光法（IFA） 用昆虫细胞裂解液中的病毒感染BHK-21 或Vero 单层细胞，37 ℃24～48 h 后，或在出现轻度细胞病变（CPE）后，用多聚甲醛、丙酮或甲醇脱水干燥将细胞固定，再用抗EHDV 血清或EHDV 特异性单克隆抗体，按照标准免疫荧光程序检测[11]。此方法特异性高，抗原制备较容易，但敏感性较低，且成本较高，对于结果判断会受一定的主观因素影响。

1.1.2.2 双抗体夹心法（sandwich ELISA）Thevasagayam 等[12]建立了一种血清群特异性双抗体夹心法，用于检测感染昆虫和组织培养制剂中的EHDV。用纯化的兔抗血清捕获病毒抗原，用豚鼠抗血清和抗豚鼠免疫球蛋白酶标记偶联物进行特异性结合检测。该方法具有EHDV 特异性，能检测8种血清型，未发现与相关病毒如蓝舌病病毒（BTV）、Palyam、Tilligery、非洲马瘟病毒（AHSV）发生交叉反应，可简单和快速检测EHDV 和区分其血清群。但该方法缺点在于选择的抗原一定要拥有2个以上的抗体结合部位。

1.1.3 血清型鉴定

1.1.3.1 高通量测序 无论分离物是否有血清特异性引物，均可以进行高通量测序；不同的测序方法可以针对不同长度的片段，测序结果可与GenBank 数据库内的序列进行对比鉴定[13]。但是各种测序方法都有各自的缺点，如成本高、耗时长、易出现测序错误等。

1.1.3.2 噬斑减少中和试验（PRNT） 将定量的病毒与不同稀释度的血清混合，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖上营养琼脂，在37 ℃和5%CO2的条件下培养，然后每天观察空斑，用Karbar法计算中和效价[14]。该方法优点是可直接对病毒进行鉴定和分型，在动物体内或体外均可，但试验条件要求较高，不能普遍开展。

1.1.3.3 微量中和试验 寇美玲等[15]对采集到的EHDV 样本与标准样本进行了中和试验鉴定。将100 TCID50标准稀释或连续稀释的未分型病毒，以50 mol/L 的浓度取5 mL 加入到平底微滴板的测试孔中，并与组织培养液中等体积的恒定稀释的标准抗血清混合；37 ℃和5% CO2孵育1 h 后，每孔加入一定量细胞，继续37 ℃和5% CO2孵育3～5 d；用倒置显微镜观察，各孔根据观察到的CPE 程度进行评分。只含有细胞或含有细胞和抗血清的孔无CPE，含有细胞和病毒的孔出现75%～100%的CPE。如果这两种病毒在试验中被中和到相似的程度，则被认为在血清上与标准EHDV 血清型相同。该方法成本低，但试验结果不稳定，对于滴定终点的判断，受操作者主观因素影响。

1.2 病毒核酸检测

1.2.1 反转录PCR（RT-PCR） 寇美玲等[15]针对致细胞病变的样品，采用EHDV 群特异性S7基因片段引物进行了RT-PCR 方法检测。RT-PCR 具有较高的敏感性和特异性，能检测出血液样本和其他组织中EHDV 的RNA，但并不能确定检测的样本中一定存在活病毒。RT-PCR 对外来核酸的污染非常敏感，包括实验室使用的任何引物或先前扩增的多核苷酸。因此，RT-PCR 对环境要求很高，必须有一个无菌操作区域，而且要配备试剂和测试所需的所有设备，这样才能保证试剂和样品不受污染。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR） qRTPCR 方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点。杨振兴等[16]和林彦星等[17]分别通过对EHDVSeg-2基因和EHDV 保守的非结构蛋白NS1 基因（Seg-5）的扩增与测序，建立了EHDV 血清型特异性qRT-PCR 诊断技术。该方法具有高度的特异性和灵敏性，可准确鉴定不同血清型EHDV，与BTV、中山病病毒（CHUV）和阿卡斑病毒（AKAV）之间均无交叉反应；qRT-PCR 反应的扩增效率均达到90%以上，对不同血清型EHDV 核酸检测灵敏度在24～44 copies/μL 之间。本方法在EHDV 感染早期就可鉴定出病毒血清型，可用于动物早期感染EHDV 血清型的快速与准确诊断。缺点是qRTPCR 检测过程中的引物和探针与EHDV 的Seg-2序列存在的一些差异，会导致引物或探针与模板的结合能力下降，从而导致qRT-PCR 检测灵敏度偏低，甚至出现某些EHDV 核酸阳性血液无法鉴定血清型的现象，同时在面对大量样本时，该方法检测成本高，效率较低。

1.2.3 多重荧光定量RT-PCR 多重荧光定量RTPCR 方法是采用多对引物扩增，检测多个模板的批量快速检测。此方法在一个反应管中同时检测多种目的基因，可以克服单重荧光定量RT-PCR 的不足，从而降低成本和提高效率，并具有特异性强、敏感性高等优点，能在较短时间内完成对多种病原体的检测。刘佳佳等[18]和杨振兴等[19]考虑到BTV 和EHDV 主要流行区域重叠，且均通过库蠓叮咬感染反刍动物而存在混合感染的可能，从而建立和完善了BTV 和EHDV 双重荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可检测不同血清型的BTV 和EHDV，与AKAV、CHUV、小反刍兽疫病毒（PPRV）、口蹄疫病毒（FMDV）和牛流行热病毒（BEFV）无交叉反应，具有较高的准确性和敏感性，且与单重荧光定量RT-PCR 相比缩短了检测时间，在动物检疫中具有实际的应用优势。缺点是多重荧光RTPCR 方法易受引物、试剂和反应条件等诸多因素影响，复合扩增中引物间、模板间和引物与模板间可能存在竞争抑制和相互干扰。例如，无论是单模板还是混合模板，具有扩增优势的样本会影响其他样品扩增的荧光强度。

1.2.4 反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）在EHDV-VP7基因保守区域设计2 对特异性引物，通过优化反应温度、Mg2+浓度等，建立的EHDV RT-LAMP 检测方法的灵敏度是普通荧光RT-PCR方法的1 000 倍，且能区分EHDV、AKAV 和水泡性口炎病毒（VSV）；反应结束后，加入SYBR Green I 染料，肉眼即可观察反应结果[20]。该反应不需要PCR 仪等昂贵的仪器，可在普通实验室进行，但容易形成气溶胶污染，假阳性问题较严重。

2 抗体检测方法

2.1 竞争ELISA（C-ELISA）

对于暴露动物血清中EHDV 抗体的检测，可采用特异性单克隆抗体C-ELISA。C-ELISA 是一种快速检测VP7 蛋白抗体的方法[21]。其优点是当样本中存在非特异性干扰时，使用该方法可避免产生假阳性结果，而且数据再现性很高，缺点是整体的敏感性和专一性都较差。

2.2 抗原捕获ELISA（AC-ELISA）

以兔抗EHDV 为捕获抗体，豚鼠抗EHDV 为检测抗体，羊抗豚鼠IgG-HRP 为酶标抗体，建立的AC-ELISA 方法具有特异性强、敏感度高和重复性好等特点，可用于EHDV 分离过程中细胞培养液检测，对于提高病毒分离效率和流行病学调查准确性均具有重要意义[22]。缺点是在试验过程中受非特异性反应影响而使结果产生一定差异。用琼脂扩散试验（AGID）检测时，与相似形态和结构的病毒如BTV 常出现交叉反应，且只能用于检测经细胞培养增殖的病毒，不能直接用于临床血液样品检测。用该方法检测带毒量高低不同的血液，以阴性血液为对照，结果仅能检出带毒量较高的血液，因而存在灵敏度低、背景较高等缺点。

2.3 血清中和试验

血清中和试验分为针对分离EHDV 毒株的病毒中和试验（virus neutralization tests，VNT）和针对感染动物的血清中和试验（serum neutralization tests，SNT）[23]。VNT 和SNT 均需准备不同血清型EHDV 的标准参考毒株或标准阳性血清，虽然结果十分准确，但试验条件比较苛刻（专业实验室才具备）。此外上述两种试验均存在操作繁杂、耗时长（5～7 d 才能出结果）的缺点。

2.4 补体结合试验（CFT）

CFT 对EHDV 检测敏感、特异，其灵敏度类似于病毒中和试验和AGID 试验。CFT 允许在感染后4～12 个月内检测和定量抗体，过后可靠性会降低，且不适用于检测老龄动物感染[24]。

2.5 琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）

AGID 简单、经济，被广泛用于检测感染动物血清中的EHDV 抗体[25]，可在感染后5～15 d，甚至2 a 或更长时间内检测到抗体[26]。然而，AGID特异性不高，不能区分BTV 和EHDV，因此AGID阳性血清应使用血清组特异性试验重新测试。

3 结语

各种检测方法在经济性、时效性、灵敏度、准确度、操作难易程度以及对操作人员和仪器环境的要求各有不同，适用的检测情况也不同。因此，在实际检测时应根据具体的检测条件和检测要求选择最合适的检测方法。目前国内外一些新兴技术，未有用于检测EHD 的报道，如时间分辨荧光微球法、数字RT-PCR、基因芯片和微流体测量技术、第三代测序技术等。后续应不断尝试应用上述新技术，进一步丰富EHD 的检测方法。