RNA 病毒重组及发生机制

（山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100）

RNA 病毒种群具有的遗传多样性，很大程度上是由其高突变率导致的庞大种群决定的。最初认为，RNA 病毒仅存在有限的重组，但经试验研究和病毒基因组序列数据库分析发现，RNA 病毒很多家族之间均可发生重组，这对RNA 病毒的出现、进化及其流行病学都有重要影响。重组与病毒宿主范围扩大、毒力增强[1-3]、逃避宿主免疫[4]和耐药[5]相关。尽管越来越多的证据表明RNA 病毒间存在重组[3，6-7]，但是重组进化发生的原因尚不清楚。为进一步探索RNA 病毒重组的原因，本文综述了重组类型、重组机制、重组率及重组相关性等方面的研究进展。

1 重组的发生及类型

RNA 病毒的进化、宿主嗜性和致病性依赖于其基因组多样性。造成基因多样性的原因主要有两种：一是核苷酸错配，主要因RNA 病毒的RNA依赖性RNA 聚合酶（RdRp）缺乏复制后矫正的活性，导致出现复制的低保真性，从而使RNA 病毒基因组中的碱基很容易出现突变[8]。二是RNA 重组或重配[9]，这需要两个或多个病毒感染同一宿主细胞才能发生，是病毒基因组RNA 分子间的核苷酸序列互换形成的。1963 年，Ledinko 等[10]首次发现了微RNA 病毒科脊髓灰质炎病毒I 型的重组现象。1985 年，科学家又发现了冠状病毒的重组现象[11]。到目前为止，已发现大多数的正链RNA病毒都有重组现象，包括微RNA 病毒、披膜病毒、黄病毒、动脉炎病毒和冠状病毒等[12-13]；RNA 重组也存在于其他一些病毒的形成过程中，如逆转录病毒、负链RNA 病毒、双链RNA 病毒以及缺陷型干扰RNA[14]。

根据病毒RNA 分子的结构、功能以及重组发生的位点，可将RNA 重组分为三大类：同源（homologous）重组、不正常同源（aberrant homologous）重组和非同源（nonhomologous）重组[15-16]。同源重组是指发生在序列相似或相近的两条亲本RNA 分子之间的重组，通常情况下，重组体不会在RNA 分子交换区域发生核苷酸的插入、替换或缺失，即重组体骨架不发生变化，因此病毒基因组基本结构不变，产生的重组体通常也具有活性。此种类型的重组比较普遍，例如微RNA 病毒的重组。不正常同源重组，与同源重组类似，也需要序列相似的两条亲本RNA 分子，但不同之处在于，重组不发生在序列同源或相似的区域，而是发生在同源序列附近的不相关区域，因此重组后的RNA 分子会产生序列重复或缺失，有时还可能会有一些未知的核苷酸序列插入。非同源重组，也称Ⅲ型重组，发生这类重组的亲本RNA 分子间没有序列同源性，重组位点的选择也不清楚，因此这种重组可能会导致RNA 病毒发生基因重排、插入和缺失。此外，根据亲本RNA 分子来源不同，这种重组又可分为基因组内重组或重配（重组链属于同一RNA 分子）和基因组间重组（重组链片段来自于不同的亲本RNA 分子）[17]。

2 重组的机制

2.1 复制型重组

大多数研究认为，RNA 病毒通过复制型重组机制进行重组。Kirkegaard 等[16]对脊髓灰质炎病毒重组的研究，是解释复制型重组机制最直接的证据。在重组过程中，RNA 聚合酶介导RNA 病毒的复制，即合成负链RNA 时RNA 聚合酶从一个RNA 分子（供体模板）转移到另一个RNA 分子（受体模板）上，而且新合成的链随RNA 聚合酶一起转移到受体模板上继续进行链的合成，进而形成嵌合的重组分子。对于大部分RNA 病毒来说，重组是通过RdRp 或逆转录酶（RT）参与完成的[18-20]。病毒RNA 具有不同的选择性遗传标记，例如对温度敏感的突变或对胍的抗性。在选择条件下，只有那些发生了重组的基因组才允许生长，因此可以对其进行分离和分析。类似的技术已用于确定冠状病毒的重组率[21-22]。最近，许多研究[1，23-24]将标记基因（如GFP）嵌合入病毒基因组中并进行传代，通过标记基因的稳定表达来研究脊髓灰质炎病毒、黄病毒以及塞内卡病毒中的重组事件。研究[25]还表明，RNA 重组发生在负链RNA 合成的过程中。此外，对流感病毒DI RNA 的结构分析，也间接证明了RNA 重组的复制型重组机制[26]。

2.1.1 重组检测系统 为更好地研究复制型重组机制，目前已构建了基于细胞的病毒重组检测系统[23，27-28]，其中一种称之为CRE-REP 系统。在该系统中，只有重组体的子代病毒才可以存活。该方法将两个不完整的RNA 基因组共转染。虽然这些基因组不能单独产生具有感染性的病毒粒子，但发生重组后将产生活的子代病毒。其中，供体分子为病毒亚基因组复制子，病毒基因组中的结构基因被报告基因（如萤火虫荧光素酶）取代。该RNA具有完全复制能力，但由于衣壳编码区的缺失，因此无法形成具有感染性的病毒颗粒。而受体分子，将病毒非结构蛋白2C 编码区内的顺式复制元件（CRE）进行点突变[29-30]，从而破坏了CRE 的功能，抑制了VPg 的尿苷酰化作用，进而阻止了病毒正链RNA 的合成[31]。因此，尽管受体RNA可以被翻译并产生负链RNA，但是它也不能产生具有感染性的子代病毒。在CRE-REP 系统中，形成重组体需要RNA 链之间的交换，且重组发生在亚基因组复制子中的功能性CRE 与结构性或非结构性编码区蛋白之间。也就是说，如果重组发生于这些区域之外，形成的基因序列将缺少基因组的基本组成部分，因而并不具有活性。为了使病毒间重组区域扩大，最近又有研究[32]表明，对于供体分子，将有功能性CRE 亚基因组复制子嵌入到基因组的3'UTR 上，这样就可以产生更多的重组体。另外，对于肠道病毒和塞内卡病毒的研究，也构建了另外一种病毒重组检测系统。该系统同样包含供体分子和受体分子[23，28]。其中：供体分子因缺乏病毒衣壳基因的部分序列，而无法形成具有感染性的病毒粒子；受体分子因缺失病毒聚合酶的活性位点GDD，使得聚合酶失活，从而不具备复制能力。单独转染各RNA 分子均不能产生子代病毒，但将二者共转染，如果发生重组，则会产生具有感染性的病毒粒子。利用相同的原理，近期也有研究[33-36]构建了第三种病毒重组检测系统。该系统的供体分子缺乏病毒的聚合酶以及整个3'UTR，而受体分子缺失基因组的顺式作用元件IRES，二者共转染后可以在基因组的结构蛋白和非结构蛋白部分发生重组。随后，通过分离重组病毒，将重组病毒的基因组序列和亲本病毒进行比较，以确定重组位点和结构变化。为了能够检测到早期重组体，采用只允许病毒复制但不易感的单层细胞。例如：对于脊髓灰质炎病毒而言，供体和受体RNA 分子可以共转染缺少病毒受体的鼠或仓鼠细胞，但产生的重组病毒不能继续感染该细胞。这样，就可以在产生的重组体开始新一轮复制前，获得病毒重组体，并对其进行深度序列分析。研究[34]发现，大多数的最初重组体基因组长度大于病毒本身，并且在重组位点包含重复序列，而在自然界中发现的重组体并没有这种不精确的重组。这表明自然界存在的重组体并不是一步形成的，而是先发生重组，而后在自然的选择过程中，删除重复序列从而获得适应性更强的重组体。

2.1.2 模板转换影响因素 许多因素会影响复制型重组机制中模板的转换。由于RNA 聚合酶的高复制速率且缺乏复制后矫正功能，导致掺入大量错误的三磷酸核苷（NTP），而这可能会引起复制复合物发生解离[37-39]。此外，在许多RNA 病毒中，供体RNA 分子中的二级结构甚至是三级结构，可能会抑制RNA 聚合酶在亲本RNA 分子上的移动，促进RNA 聚合酶和新合成的核酸链转移到另一个受体RNA 分子，从而促进模板的转换[40-41]。作为模板的RNA 序列之间的同源性，或者作为介导聚合酶解离或重新结合的特定序列，在重组中的影响作用尚未得到充分研究。已有报道[42-44]，重组交换的区域偏向于RNA 模板之间序列同一性的区域。因此，RNA 重组通常是“同源”的，因为这种情况经常发生于具有高度序列相似性的区域。当然，两个亲本序列之间的序列相似区可能接近交叉点，而不一定是交叉点。对于脊髓灰质炎病毒的研究发现，型间重组的频率低于型内重组的频率，表明序列同一性对重组具有积极的影响。但是，对具有有限序列同一性区域的基因型内重组体的序列分析显示，这些区域与重组交换之间并没有相关性[27]。然而，基因相异的不同基因组区域或者无关的RNA分子之间交换产生的“非同源”重组现象也时有发生。由于发生非同源RNA 重组的区域之间序列相似性很低，所以经常会产生有害的基因型，这可能是非同源重组并不像同源重组一样常见的原因之一。目前，运用直接的试验方法和生物信息学方法寻找进化树之间的不一致，已经确定了各种RNA病毒中同源和非同源重组的实例[27，34，45]。此外，在很多病毒家族中，已经观察到包含截短病毒基因组的病毒突变株，也就是缺陷性干扰颗粒[46-48]。这些截短的病毒基因组的产生是RNA 聚合酶合成能力下降的结果，并且可能是通过复制型重组机制所产生[49]。此外，由断裂导致的模板转换，与上述机制明显不同，可能是由于供体RNA 断裂导致复制中止，进而引起模板转换。目前，也有研究发现宿主和环境因素也会影响复制型重组。如对于低毒力病毒和番茄丛矮病毒以及黄瓜黄叶病毒，许多细胞通路和因子会影响复制型重组[50-53]。

2.2 非复制型重组

非复制型RNA 的重组率较复制型低很多，并通过试验[54-56]得到了证实。在非复制型重组过程中，重组RNA 分子在特定的位点被切割，然后连接形成重组分子。通过对PV RNA 分子的研究，首次发现了非复制型重组的机制。Gmyl 等[56]分别构建了在基因组5'端或3'端有缺陷的两组PV 突变体，结果发现将二者分别感染宿主后，在体内均无法进行有效复制，而将二者共感染宿主细胞却可以产生有活性的重组子代病毒。最近的研究[57-58]表明，经过非复制型重组的5'或3'端均不需要被翻译，这也就暗示了非复制型重组不需要病毒蛋白参与。而这与复制型重组截然不同，复制型重组需要病毒聚合酶的参与，而且聚合酶的结构和活性在一定程度上影响重组的发生。据推测，基因组RNA 在复制前已在某些位点被剪切，然后交错连接形成新的重组体RNA，这可能与RNA 分子本身的转酯反应或者宿主细胞中特殊核酸酶和连接酶的作用有关。而一些发生交叉的区域还可折叠成锤头核酶样结构。与序列相似性引起的重组作用相比，RNA 的二级结构被认为是介导非复制型重组的主要因素，但由于复制和非复制型重组机制的终产物可能相同，因此无法准确确定重组体的来源。

2.3 重配

重配是分节段病毒遗传相关RNA 基因组间发生整个RNA 分子的互换，是RNA 病毒中基因组间交换的另外一种形式。与RNA 重组一样，重配也需要一个以上不同的病毒粒子感染同一个细胞。尽管在复制过程中重配不需要亲本基因组间存在很高的相似性，但导致重配病毒产生的包装过程并不是完全随机的[59-61]。

分节段病毒可能是两个或者多个病毒共感染同一个细胞产生的，随后通过互补逐步演化，最终通过相互作用形成功能性的病毒粒子。例如，分节段的植物病毒经常以较高的感染复数（MOI）共感染一个普通宿主，从而导致混合感染[62-64]。事实上，许多寄生于植物体内的单股正链RNA 病毒基因组是分节段的。这些基因组分别包裹于不同的颗粒中，也就是所谓的多粒子性病毒，其中包括雀麦花叶病毒科、豇豆花叶病毒科以及帚状病毒科的一些成员。分节段基因组也可直接从不分节段基因组进化而来。特别是RNA 病毒在体外以高MOI 传代的过程中经常会产生缺陷型干扰颗粒，而且一些缺陷型干扰颗粒可以通过互补作用重新获得感染性[65]，其核酸代表该病毒早期的基因组片段。

病毒RNA 的重组和重配，在初期形成有害基因型时可能有区别。但这两个过程可能会在同一个单一基因组中产生不相容的突变[66]。这种突变不仅会加大亲本株之间的系统发育距离，而且这个距离还会根据重组位点相对于基因、蛋白质和蛋白质结构域的具体位置而发生变化[67]。此外，重配过程可能会破坏共同进化分子间的相互作用[68-69]，而且这种作用在节段基因组编码多蛋白复合物时可能尤为强烈。

3 重组率

尽管目前还没有证据准确表明每一个核酸或者基因组的重组率，但是在RNA 病毒中RNA 的重组和重配率还是非常高的。例如，对于肠道病毒而言，在共感染试验中，每代每个位点发生重组的概率为10-6[70]，且这些重组会发生在同一类型的病毒之间、同一病毒的不同型之间，甚至是不同病毒的5'UTR 之间[71-74]；而一些逆转录病毒，比如人类免疫缺陷病毒（HIV），其每代每个位点发生重组的概率为1.38×10-4～1.4×10-5[75-76]；一些单股正链RNA 病毒，比如微RNA 病毒科的肠道病毒以及冠状病毒科、雀麦花叶病毒科、马铃薯Y 病毒科的病毒也具有很高的重组率[77-80]。然而，其他一些单股正链RNA 病毒的重组率却非常低，例如黄病毒科病毒只有零星的重组[24，81]；在共感染试验中，丙型肝炎病毒（HCV）每个位点每代RNA 重组率仅为4×10-8[82]。还有一些单股正链RNA 病毒，比如杆菌状核糖核酸病毒科、光滑病毒科、裸露核糖核酸病毒科和甜菜坏死黄脉病毒科的成员，并未观察到重组现象。

尽管负链RNA 病毒含有分节段基因组，可以发生重配，但其重组率却低于正链RNA 病毒[83-84]。例如，对从甲型流感病毒中分离到的上千种基因进行序列分析，发现此病毒存在零星的同源重组[85]，然而这个病毒却经常发生重配[86-88]。总的来说，负链RNA 病毒重组率低可能表现在它们生活周期的一些具体方面。

重要的是，RNA 病毒间重组率的不同可能与它们之间一些基本的生物学性质差异有关。例如HIV 会形成持续性感染，在一个单一宿主内发生混合感染的概率会增大，这可能会产生较高的重组率。同样，在宿主体内是否能有效地而且有规律地发生共感染，也会在一定程度上影响重组率。基因组结构的确定，可更清楚地了解重组。例如，逆转录病毒基因组的构成有利于基因重组的发生。逆转录病毒基因组含有两个RNA 分子，可以形成“假二倍体”。其结果是，具有不同祖先、能同时感染一个宿主细胞的病毒可以被包装在一起，产生“杂合”的病毒粒子，进而通过复制以及选择重组产生遗传上不同的子代病毒。据估计[89-90]，在HIV-1 逆转录时，每个复制周期转换模板2～20 次，从而超过了该病毒每个核苷酸测得的突变率，使其成为所有RNA 病毒中最易发生重组的病毒。然而，并不是所有的逆转录病毒都与HIV 一样发生高比例的重组。例如，鼠白血病病毒（MLV）与一般的γ 逆转录病毒，尽管二者具有非常相似的复制型重组发生率，但它们的重组率却比HIV 少90%～99%[89-90]。

同样，重配率在病毒间也存在着非常广泛的变化。具体来说，分节段病毒（汉坦病毒、拉沙病毒和水稻草状矮化病毒）表现出相对低水平的重配[91-93]。而其他一些病毒似乎较为频繁地发生重配，例如：甲型流感病毒，每年至少发生2～3 次重配事件；每年有2.7%～5.4% 的轮状病毒发生了重配[94-95]。事实上，在甲型流感病毒和A 型轮状病毒中，编码病毒表面蛋白的不同基因节段可发生重配。这些表面蛋白包括甲型流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）以及A 型轮状病毒的VP7 和VP4。重配的后果与病毒逃避宿主免疫以及病毒的流行相关[96-98]。

4 RdRp 与病毒重组的相关性

突变和重组对于RNA 病毒的适应和进化至关重要[99-100]。最近，对于肠道病毒和甲型流感病毒重组的研究[32，48，101]表明，两者均主要由RdRp 介导。实际上，这些最新研究表明RdRp 保真性也与病毒重组效率相关。例如，低保真性RdRp 的辛德必斯病毒易于重组，从而导致缺陷干扰颗粒的过度生产[48]。此外，聚合酶保真性的改变也影响了脊髓灰质炎病毒的重组率[32]。另外，对脊髓灰质炎病毒的研究[1]表明，重组是病毒进入中枢神经系统所必需的，并且重组可以在不改变最佳突变率的情况下提高适应性。

在复制型重组的过程中，正常的延伸停止，导致部分基因组可以退火到新模板链上，并重新启动延伸过程，最终产生由两种模板组成的全长基因组。RNA 合成的重新启动通过RNA-RNA 双链体发生，这个过程需要一定的序列同源性及互补性，以便正确进入病毒聚合酶3Dpol的活性位点。在细胞内膜结合的病毒复制中心结构中，发生重组的特定结构和分子机制尚不清楚，但最近鉴定的3Dpol突变体提供了对该过程的一些见解。

在这些突变体中，有些是通过有限稀释法分离能稳定表达绿色荧光蛋白基因的病毒突变体而获得的，其原理可能是，由于重组率下降导致病毒删除外源基因的效率降低[1，23，41]。筛选得到PV 3Dpol第79 位的Asp 突变为组氨酸（D79H），其重组率较野生型毒株降低约90%；塞内卡病毒3DpolS460L 和 I212/S460L 突变株，其重组率较野生型毒株分别降低约82% 和97%，但均不影响病毒的适应性[23]。D79H 突变位于手掌亚结构域底部的3Dpol表面上，并且它远离延伸复合物中的RNA。从结构的角度来看，重组效应不太可能是由于3Dpol-RNA 直接接触的变化导致的，并且长孔有序α-螺旋的中间位置也没有显示对蛋白质构象动力学有影响。因此，难以在单个3Dpol-RNA 复合物的背景下，确定该重组突变产生的作用机制，并且Asp79 残基很可能在膜相关病毒复制中心的更高级组织中起作用。

通过寻找延伸复合物中3Dpol-RNA 界面突变引起的重组效应，随后进行定点突变，获得的重组突变体是Leu420 至丙氨酸突变[28]。Leu420 位于新合成的RNA 链离开聚合酶通道中的拇指结构域α-螺旋上，并且它与产物RNA 链上的活性位点外的第三核苷酸核糖基团直接相互作用。在不同的细胞类型中，带有L420A 聚合酶突变的病毒，其重组率降低93%～98%。体外生化测定显示，L420A聚合酶具有与野生型相同的延伸率，但其起始速率下降，并且延伸复合物的稳定性也下降。这些观察结果表明，3Dpol与RNA 间的相互作用发生了改变，这可能是由于Leu420 与产物RNA 链的直接相互作用所导致的。值得注意的是，相邻Leu419 残基的类似突变，使得3Dpol与模板RNA 链发生相似的相互作用，但是并不会影响重组，表明该效应是链特异性的。在重组过程中，部分产物链成为重新起始反应的引物链。该研究表明，L420A 突变改变了形成的引物链结构。这种结构的变化，会改变活性位点中3'羟基的位置和取向，因此也就降低了重新起始RNA 链合成的效率和重组率。

对于脊髓灰质炎病毒而言，3DpolD79H 突变既抑制了RNA 重组，同时对核苷类似物的抵抗力也不变；而L420A 突变不仅抑制了RNA 重组，而且对核苷类似物的抵抗力也有所下降。对于塞内卡病毒而言，聚合酶重组缺陷毒株对于核苷类似物的抵抗力也在下降。针对这种发现，最近的研究[102]表明，病毒聚合酶具有平衡RNA 复制保真性和RNA重组频率的固有能力，以维持病毒种群的整体适应性。但RNA 重组的频率如何影响RNA 复制的保真度、核苷类似物的敏感性和病毒进化，仍然需要进一步探究。

5 未来研究方向

RNA 重组对RNA 病毒的研究具有实质性意义。

一是，RNA 重组是衡量减毒活疫苗的一个重要参数。如PV 减毒活疫苗，重组会发生在疫苗株之间或者疫苗株与其他病毒之间从而产生新的病毒。幸运的是，到目前为止，这些重组的病毒并没有产生非常严重的后果。然而，产生致命性影响的案例确实存在[103]。

二是，RNA 重组可用作构建病毒突变株的遗传操作工具，尤其是用于尚未获得感染性克隆的病毒。例如，冠状病毒基因组庞大，获得感染性克隆比较困难。构建复制的病毒与转染的RNA 片段之间的重组系统，可规避这一难题，为构建重组病毒株提供了一个新途径。

三是，尽管迄今为止仅在一些RNA 病毒中证实了RNA 重组的发生，但是重组很可能是普遍存在的现象。只有利用合适的实验系统和程序，才能检测到病毒重组的产生。

由于RNA 重组机制的复杂性，目前仍有很多有关RNA 重组的问题尚不明确。更深入地了解重组机制，也许能够更好地预测重组病毒发生的方式和位点，并为可能产生的潜在后果做更好准备。例如：RNA 聚合酶的哪种特性会决定RNA 重组率，以及还有哪些蛋白参与重组。尽管研究已表明，病毒聚合酶可以参与复制型重组，但仍需要进一步对聚合酶活性进行研究，尤其是聚合酶保真性、错掺和重组之间的关系；病毒聚合酶引起的高突变率更有可能导致模板和酶之间解离后重新结合的速率增加，从而导致重组的发生。又或者，在准种的产生过程中，重组和突变之间存在更复杂的关系。另外，许多RNA 病毒的聚合酶寡聚化为更高级的结构[103]，而这种高级结构是否会通过影响聚合酶与RNA 模板之间的相互作用在重组中起作用，目前尚不清楚。此外，其他的 RNA 结构，例如基因组环化[104]等，在病毒重组过程中的重要性也尚未确定。而且其他病毒蛋白或宿主细胞蛋白在重组过程中的作用也尚不明晰。如果不同病毒间重组所需的蛋白确实不同，那么这就有可能是病毒间重组限制的原因。此前有研究[27]表明，微管聚合反应的抑制剂——诺考达唑，可减少重组的发生。这表明即使是两个亲缘关系相近的病毒，若其利用细胞内不同的膜蛋白形成复制复合物，那么也可能永远不会产生重组。

体外重组系统的发展以及深度测序可能有助于整个RNA 群体重组过程的探究。此外，通过RNA 重组还可以进一步了解病毒的生命周期，并通过改造降低病毒的毒力和致病性。通过构建不同的重组系统和RNA 病毒的突变株，可以发现用于病毒转录的调控元件。因此，深入了解病毒重组机制并发现其中的规律，可实现新型病毒以及新疫情的预警预报，从而有预见性地控制疫病的发生和流行。