小反刍兽疫诊断方法研究进展

肖 敏，张 梅#

（甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046）

小反刍兽疫（Peste des petits nuninants，PPR）曾被称为羊瘟（Goat plague）、小反刍兽瘟（Pest of small ruminants）、肺肠炎或口炎—肺肠炎复合症或综合征（Pneumonia-enteritis or stomatitis-pneumoenteritis complex or syndrome）、伪牛瘟（Pseudo-rinderpest）和卡他（Kata）等，是山羊、绵羊及野生小反刍兽感染小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）后引起的一种以高热稽留、眼鼻分泌物增多、口腔糜烂、肺炎和腹泻为特征的急性接触性传染病[1～2]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的疫病，各国无疫状态需要经过OIE的官方认证，我国将其列为一类动物疫病。在该疫情发生时，山羊的发病率几乎达到100%，死亡率高达20%～90%，严重暴发时死亡率甚至高达100%[3～4]。

自1942年，法国首次正式报道小反刍兽疫发生于西非的科特迪瓦（原名象牙海岸）以来，随后非洲的一些国家（如尼日利亚和乌干达等）相继发生。近年来，该病逐渐蔓延至中东、西亚及南亚各国，我国周边的国家和地区亦呈地方性流行，对当地养殖业造成巨大损失，由此带来的国际贸易限制将会造成进一步的经济损失。2007年7月26日，我国西藏自治区日土县首次发生小反刍兽疫疫情，随后几年，疫情仅限于西藏地区[5]。2013年底，新疆暴发小反刍兽疫疫情，并蔓延至国内其他省、市及自治区，作为一种重大的动物疫病，已严重威胁着我国的动物卫生安全和养羊业的健康发展，2021年我国新疆、青海、西藏等省份相继发生小反刍兽疫，给养羊业造成严重的经济损失。

1 病原特征

PPRV属于副黏病毒科麻疹病毒属的成员，是具有囊膜的负链RNA病毒。从3′端至5′端依次为N-P-M-F-H-L 6个基因，其基因组大小为15 948 bp，遵循六碱基原则[6]。基因组3’末端为基因组启动子，5’末端为反基因组启动子。每2个基因之间存在基因间隔区，分别编码病毒6种结构蛋白和2种非结构蛋白。PPRV病毒粒子呈多形性，大多呈圆形或椭圆形，直径约为400～500 nm，电镜下可见病毒粒子的囊膜上有2种糖蛋白纤突，长度约8.5～14.5 nm，由融合蛋白和血凝素蛋白构成。

小反刍兽疫病毒粒子在pH值偏中性时稳定，过酸过碱均可使其失活，非离子去垢剂能将囊膜表面的纤突脱落，从而降低病毒的感染力。大多数化学灭活剂都可将其灭活，如2%的NaOH等。在紫外线和光照等自然条件下均可使其失去活力，50 ℃置于30 min可使其丧失感染力。

2 诊断方法研究进展

2.1 初步诊断

可通过临床观察、特征性症状、流行病学、死后剖检病变可做出初步诊断。

2.2 实验室诊断

2.2.1 样品采集

棉拭子样品：对于活畜，用棉拭子采集发病羊的眼结膜分泌物、鼻分泌物、口腔刮取物及肛门排泄物。全血样品：在发病早期，采集全血加入抗凝剂，必要时加入抗生素抑制细菌生长。组织样品：采集一些有典型病变的组织样品，如肠系膜、支气管淋巴结以及肺脏、脾脏、扁桃体等器官组织。各种样品的保存条件如下：血清应置于-20 ℃长期保存；棉拭子样品、组织病料应置于-80 ℃保存；组织病理样品不能冷冻，可在福尔马林溶液中室温保存。

2.2.2 病毒的分离

PPRV能在牛和羊的原代细胞中分离和培养，一般病毒在接种后10～30 min为吸附期，在第2～6小时是隐蔽器，自第24 小时直到第7 天病毒以出芽方式生出。当多核细胞出现芽生时即停止。细胞在接种病毒后的第6～15天出现病变，呈“钟表盘”。病变的特点是出现多核细胞，细胞中央为一团细胞质，周围有一个折光环，细胞核内有嗜酸性包涵体（1～6个），周围有一较亮的晕环。

2.2.3 病毒抗原的检测

（1）琼脂凝胶免疫扩散试验：样品可以选择口鼻分泌物、眼分泌物、肛门排泄物和组织病料，以进行病毒抗原的检测，而不必使用动物死后剖检病料。但是，该方法的敏感性有限，而且所需时间相对较长，因此使用受到限制。

（2）对流免疫电泳：Majiyagbe于1984年建立了该方法。是最快的病毒抗炎检测方法。通过对比AGID和CIEP可以明显观察到，CIEP的敏感性要显著高于前者，并且有的样品最短在30 min就可以观察到结果。

（3）免疫组织化学：Kumar等研究了强毒株PPRV实验感染山羊后的致病性并应用免疫组化方法对病毒分布进行了分析。结果显示病毒分离株（PPR/Izatnagar/94）具有高毒力，能引起山羊100%死亡率，在特定器官中，如肺脏、肠和淋巴组织中具有特征性病理变化。

（4）血凝试验：根据报道，PPRV具有血凝活性，根据这一特点有研究者建立了特异性、快速和廉价的血凝试验诊断方法。因为牛瘟病毒不能凝集红细胞，因此HA还能区分PPRV和RPV。

2.2.4 病毒核酸的检测

（1）核酸杂交技术：利用针对N基因的32P标记cDNA探针，可用于小反刍兽疫和牛瘟的鉴别诊断。但是该方法又有一定的缺陷，如32P半衰期短（14 d）、对样品新鲜要求程度高，以及需要特殊防护装备，现已基本不用。后来又有使用生物素或地高辛标记的探针鉴别诊断PPRV和RPV，该方法非常特异、快速，但灵敏性较使用放射性探针较低。

（2）RT-PCR：RT-PCR的灵敏度是常规病毒分离的1 000倍，可以在5 h内得到结果，而且特异性非常好。为避免在基因的RT-PCR中出现假阴性结果，Balamurugan等提出了在单管中进行的针对N和M基因的一步多重RT-PCR。

（3）环介导等温核酸扩增：目前已经建立了针对小反刍兽疫病毒N基因和M基因的一步法反转录环介导等温扩增技术[7]，通过在保守区域设计引物，优化反应条件，在63 ℃条件下经大片段酶的扩增，可实现目的核酸片段的大量扩增，由于在反应时加入了荧光指示试剂，检测结果可用肉眼直接判定，避免了电泳操作带来的污染问题，该方法特异性和灵敏度均较高。LAMP配合使用实时检测设备，使该技术在田间或野外具有广泛的应用前景。

（4）纳米金标记核酸探针：陶春爱[8]等利用纳米金建立了检测小反刍兽疫病毒的快速方法，灵敏度高和操作简单，所需检测时间仅需要1.5 h，初步检测PPRV核酸最低浓度可达10 fmol/L。

2.2.5 血清学检测

（1）病毒中和试验：病毒中和试验具有很强的特异性可以区分PPR和RP血清抗体，但需要至少7 d，花费时间较长，并且需要实验室具备细胞培养设备[9]。

（2）间接ELISA：Zhang等使用大肠杆菌表达的PPRV西藏株的N蛋白作为抗原，建立间接ELISA，通过对697份血清样品的检测报告显示，c-ELISA商品化试剂盒相比，该方法的灵敏性和特异性为96.7%和96.1%。

（3）阻断ELISA：阻断ELISA与c-ELISA的不同之处是c-ELISA将待检血清和单克隆抗体两种试剂同时加入；b-ELISA将待检血清先与预先固相包被的PPRV抗原反应，然后再与单抗孵育，产生的灵敏性和特异性均优于c-ELISA方法[10]。b-ELISA被证明与VNT的灵敏性和特异性接近，更简便更快，可以替代VNT用于小反刍兽疫流行病学监测。

（4）竞争ELISA：竞争ELISA是OIE规定的标准的检测的方法之一。建该方法是在抗PPRV单克隆抗体与血清中的抗体竞争结合PPRV抗原位点基础之上建立的。Zhang等建立了基于N蛋白抗原表位的c-ELISA，用于检测PPRV西藏毒株的抗体，与商品化试剂盒相比较测试1039份血清样品，其敏感性和特异性分别为96.18%和91.29%。龙云凤等利用建立的cELISA方法对222份血清样品进行检测，与参考试剂盒相比较得到98.20%的符合率[11]。

（5）夹心ELISA：夹心ELISA是用多克隆抗体捕获临床样品中的PPRV抗原，用针对蛋白的单抗监测捕获的抗原。Saravanan等建立的s-ELISA方法特异性达92.8%，敏感性达88.9%，且在2 h内即可获得实验结果，特别适用于临床样品的检测[12]。

3 PPR的预防

PPR的发病率和死亡率较高，目前无有效的治疗性药物，而利用RNA或纳米颗粒干扰技术的治疗方法存在一定的局限性且研究尚不深入，因此对该病的预防主要依靠疫苗的免疫接种。在缺乏商品化疫苗的年代，采用抗血清首免及全血加强免疫的方式免疫动物，可起到一定的疫病预防作用。随着20世纪80年代PPRV野毒株毒力的成功致弱及同源弱毒苗的商品化，上述古老的免疫方式随之淘汰。由于PPRV和RPV存在的抗原交叉性，牛瘟弱毒苗曾经作为异源疫苗用于PPR的防控。由于PPR弱毒苗免疫持续期长、免疫效力高目前已得到广泛应用。但其也具有一定确缺点不能区分免疫动物和自然感染动物等。

新一代候选疫苗，如活病毒载体疫苗，由于可携带单一保护性抗原基因，因此诱导的免疫反应不同于自然感染情况，从而可区分免疫动物和自然感染动物。然而，这类疫苗目前还处在研究阶段，并没有达到商品化，现在的研究为将来的应用奠定基础。具有DIVA特性的新型疫苗的研制尤为重要，有利于该病的防控，更利于某个地区长期的血清学监测。就目前的研究现状而言，活病毒载体疫苗最有希望成为DIVA疫苗的候选。

小反刍兽疫从1942年发现至今，人们对其的研究工作一直从未停歇，致力于制定一个持久而协调的方案来控制和根除疾病，借助于牛瘟根除的历史经验，目前更为迫切的是需要一个类似于全球消灭牛瘟的国际性项目，以便指导全球性的消灭小反刍兽疫。