沉默调节蛋白4在胃癌组织中的表达及其预后价值

梅佳 李军

作者单位：430014武汉 华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肿瘤科

我国胃癌的发病例数和死亡例数约占全世界的50%，疾病负担较严重［1］。而目前胃癌的早诊率依然较低，大部分患者确诊时已处于进展期。手术、放疗、化疗、分子靶向及免疫治疗等虽然在一定程度上改善了胃癌的治疗效果［2-3］，但预后仍不理想［4］。其中复发转移是导致胃癌患者死亡的首要原因［5］。而胃癌的发生、进展和转移是一个多基因、多条信号通路参与的复杂过程，具体作用机制仍不明确［3］。因此进一步探究胃癌发生发展过程中涉及的基因表达改变，有望找到新的治疗靶点。沉默调节蛋白（sirtuin，SIRT）是一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶家族，由SIRT1～7等7个成员组成，其异常表达与人类多种疾病的发生发展密切相关［6］。其中SIRT4是去乙酰化酶家族中特征最不明显的成员之一，既往研究发现其在乳腺癌、食管癌、结直肠癌和膀胱癌等多种实体恶性肿瘤中表达下调，且扮演抑癌基因的角色［7］。但SIRT4在胃癌中的作用尚未明确。本研究检测117例胃癌组织中SIRT4的表达并分析其与患者临床病理特征及预后的相关性，以期阐明SIRT4在胃癌中的作用及其作为治疗靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性收集2013年10月—2014年10月于武汉市中心医院接受胃癌根治术治疗的117例胃癌患者的癌组织及其癌旁正常组织（距癌组织边缘5 cm以上）。入组标准：⑴经组织病理学确诊为胃腺癌；⑵术前均未接受抗肿瘤治疗；⑶具有完整的临床病理资料和5年随访信息。排除标准：⑴术前已转移、接受姑息性切除的患者；⑵合并其他恶性肿瘤既往史者。纳入患者的平均年龄为（63.7±9.0）岁；男性68例，女性49例。本研究经武汉市中心医院医学伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 免疫组化检测胃癌组织中SIRT4蛋白的表达

取组织石蜡切片置于恒温箱中烘烤脱蜡，再置于二甲苯中脱蜡2次，酒精梯度水化后，3% H2O2去离子水（无色液体）孵育10～30 min，以灭活内源性过氧化物酶活性。山羊血清封闭15～30 min后，加入SIRT4一抗（1∶200稀释，美国Abcam公司），4℃孵育过夜；次日滴加标记有HRP的二抗（山羊抗兔二抗，武汉赛维尔生物科技有限公司），室温孵育30 min；显色剂（DAB）显色，显微镜下控制反应时间；苏木素复染，逐级脱水、透明、中性树胶封片染色。在奥林巴斯光学显微镜下进行阅片和结果判定。

1.3 免疫组化染色结果判定

免疫组化染色结果判定根据染色强度及阳性细胞百分率进行。染色强度：0分（阴性），1分（弱阳性，淡黄色），2分（中等强度，黄色）和3分（强阳性，棕黄色或褐色）；阳性细胞百分率：0分（≤5%），1分（6%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（≥76%）。两项评分的乘积为最终评分，总分≤3分定义为低表达，＞3分定义为高表达。

1.4 资料收集及随访

收集患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移状况、淋巴脉管浸润状况、神经侵犯状况、术前癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平及TNM分期等临床资料，其中TNM分期采用国际抗癌协会（Union for International Cancer Control，UICC）第7版肿瘤分期系统。采用电话或门诊复诊随访，随访截止时间为2019年9月30日，记录患者的总生存期（overall survival，OS）。OS定义为确诊之日至死亡或末次随访的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。采用配对样本t检验分析SIRT4在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平差异；采用χ2检验分析胃癌组织中SIRT4蛋白表达水平与患者临床病理特征的关系；采用Kaplan-Meier法计算总生存率并绘制生存曲线，组间差异比较采用Log-rank检验；采用单因素Cox回归分析影响患者OS的相关因素，将差异有统计学意义的因素纳入多因素Cox比例风险模型。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT4蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达

免疫组化检测结果显示，SIRT4蛋白表达主要定位于细胞质，在胃癌组织和癌旁组织中均有表达，且在癌组织中的表达低于癌旁组织［（2.138±1.306）分vs（9.582±3.243）分，t=19.078，P＜0.001）］，见图 1。

图1 SIRT4蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达Fig.1 The expression of SIRT4 in gastric cancer and paracancerous tissues

2.2 SIRT4蛋白表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系

胃癌组织中SIRT4低表达率为62.39%（73/117），SIRT4蛋白表达水平与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴脉管浸润、神经侵犯及TNM分期有关（均 P＜0.05），见表 1。

表1 SIRT4蛋白表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系（n）Tab.1 Relationships between SIRT4 protein expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients（n）

2.3 SIRT4表达水平与胃癌患者OS的关系

本组中位随访时间为58.2个月，随访期间，死亡60例，失访11例。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验结果显示，SIRT4低表达组1年、3年、5年的总生存率分别为100.0%、61.6%、37.0%，SIRT4高表达组分别为100.0%、86.4%、68.2%，SIRT4低表达组的总生存率低于 SIRT4高表达组（χ2=11.244，P=0.001），见图2。

图2 SIRT4高表达和低表达胃癌患者的生存曲线Fig.2 The survival curves of gastric cancer patients with high and low expression of SIRT4

2.4 影响胃癌患者OS的单因素及多因素分析

单因素分析结果显示，肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴脉管浸润、神经侵犯、TNM分期及SIRT4表达水平与胃癌患者OS有关（均P＜0.05）；进一步多因素Cox回归分析显示，SIRT4蛋白低表达是影响患者OS的独立危险因素（HR=2.241，95%CI：1.252～4.165，P=0.021），见表 2。

表2 影响胃癌患者OS的单因素和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analysis of OS in patients with gastric cancer

3 讨论

SIRT4是位于线粒体上的NAD+依赖ADP核糖转移酶，通过抑制谷氨酰胺脱氢酶活性可抑制细胞内的谷氨酰胺代谢途径，从而发挥抑癌基因功能，广泛参与多种恶性肿瘤进程［7］。既往研究表明，SIRT4在多种恶性肿瘤中表达下调，且与不良预后有关［7-9］。MIYO等［8］研究发现，SIRT4在结直肠癌组织中表达降低，且其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴脉管浸润、远处转移及TNM分期呈显著负相关，生存分析显示低表达患者的无复发生存时间显著缩短。也有研究报道SIRT4表达水平与食管癌患者临床病理特征无关，但多因素分析显示SIRT4低表达是影响预后的独立危险因素［9］。GONG 等［10］通过分析 TCGA数据库发现SIRT4在非小细胞肺癌中高表达，且SIRT4高表达预示生存期更长。本研究发现SIRT4在胃癌组织中呈低表达，且SIRT4低表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴脉管浸润、神经侵犯及TNM分期等不良临床病理特征相关。进一步预后分析发现，SIRT4低表达患者的总生存期明显缩短，且是影响预后的独立危险因素，提示SIRT4在胃癌的发生发展中可能扮演抑癌基因角色。目前有研究表明，SIRT4可能通过影响肿瘤细胞的代谢和生物学活动参与肿瘤进展过程，从而影响患者预后［11-14］，但SIRT4抑制胃癌发生发展的分子机制仍尚未知，需进一步探索。

本研究结果证实，SIRT4蛋白在胃癌组织中低表达，且其低表达与患者的恶性临床病理特征及不良预后密切相关，也是影响患者总生存期的独立危险因素。因此，SIRT4有望成为胃癌患者预后评估标志物及潜在的治疗靶点。但本研究为单中心回顾性研究，且样本量有限，因此有关结论仍需进一步研究证实。