TRPM7通过PI3K/AKT/ERK信号途径影响脑胶质瘤细胞增殖、上皮-间质转化

吴鹏飞 王昀 秦虎 刘洋 吴金泽 王增亮

作者单位：830054 乌鲁木齐 新疆医科大学第一附属医院神经外科

脑胶质瘤是常见的原发性颅脑恶性肿瘤，手术辅助放疗或化疗是目前临床上的标准治疗策略［1-2］。然而，由于持续的肿瘤生长或细胞侵袭，导致脑胶质瘤患者的高死亡率，大多患者预后较差［3］。因此，众多学者致力于阐明其发展机制并寻找特异性的治疗靶点，以提高脑胶质瘤的治疗疗效。瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道家族包括生物跨膜蛋白，通过调节细胞质信号和细胞反应而在多种生理和病理过程中起重要作用［4］。M型顺时受体电位通道7（melastatin transient receptor potential channel 7，TRPM7）是TRP通道家族的成员，具有非选择性阳离子通道和蛋白激酶功能［5］。目前研究发现TRPM7在多种肿瘤中高表达［6-7］，且在恶性肿瘤进展中起重要作用，包括调节细胞增殖、黏附、凋亡、基因表达、细胞迁移和转移等［8-9］。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）已被证实在肿瘤的发生和侵袭转移中起关键作用［10］，且受多种信号传导途径调节，包括PI3K/AKT和ERK等途径［11-12］。本研究利用shRNA转染脑胶质瘤U251细胞构建TRPM7低表达稳定细胞株，观察沉默TRPM7对U251细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K/AKT/ERK信号途径的影响，为明确TRPM7在脑胶质瘤进展中的重要性及其作为新的治疗靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

人正常星形胶质HA1800细胞株、脑胶质瘤细胞株（U251、U87、U373）购自中国科学院上海细胞生物学研究所。DMEM培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司。TRIzol试剂、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自日本TaKaRa公司。shNC和shTRPM7购自上海吉玛制药技术有限公司。LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司。8 μm孔径的小室购自美国Promega公司。细胞免疫荧光染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Abcam公司。TRPM7抗体购自美国Santa cruz公司。E-cadherin抗体、Vimentin抗体、PI3K 抗体、p-AKT抗体、AKT抗体、p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体购自美国 Cell Signaling Technology公司。荧光二抗（兔抗）购自赛默飞世尔科技有限公司。CKX53倒置生物显微镜购自日本Olympus公司。StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 细胞培养

细胞用含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2 d更换1次培养基。取对数期、状态良好的细胞进行后续实验。

1.3 细胞转染

U251细胞以1×105/孔接种于24孔板，实验分3组：U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组。待细胞生长汇合率至60%左右，按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书转染U251细胞，U251/shNC和U251/shTRPM7组分别转染shNC和shTRPM7，U251组为未转染的U251细胞。其中shNC、shTRPM7的转染终浓度为50 nmol/L，转染48 h后收集各组细胞进行后续实验。

1.4 细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力

转染48 h后的各组细胞经胰酶消化，然后以1×103/孔接种于60 mm细胞培养皿中。10 d后，用结晶紫溶液染色细胞，并计数含有≥50个细胞的集落，显微镜拍摄代表性集落并统计。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

细胞迁移能力检测中各组细胞转染48 h后，胰酶消化制成单细胞悬液，细胞密度为1×106/mL。在小室的上室加入细胞悬液100 μL，下室加入含10% FBS的完全培养基500 μL。将小室置于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育8 h。取出聚碳酸酯微孔膜，用棉签轻轻擦去基底胶和上表面的细胞，然后用中性甲醛固定、苏木素染色。用显微镜观察迁移的细胞数量。细胞侵袭能力检测方法同上，但用聚碳酸酯微孔膜包被人工基底胶。

1.6 细胞免疫荧光染色实验检测细胞中E-cadherin和Vimentin的表达

用4%多聚甲醛固定转染后的各组细胞10 min，然后在室温下将细胞于0.1% Triton X-100中透化20 min，与一抗在4℃下孵育过夜，然后与荧光二抗在室温下孵育1 h，PBS洗涤3次。DAPI复染，然后在荧光显微镜下观察并拍照。

1.7 qRT-PCR检测细胞中TRPM7 mRNA的表达

采用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA。紫外分光光度计检测总RNA的纯度和含量。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。TRPM7引物序列：正向5′-TAGCCTTTAGCCACTGGAC-3′，反向 5′-GCATCTTCTCCTAGATTTGC-3′；β-actin 引物序列：正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。用TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR条件：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5s、60℃ 30 s，40个循环。使用StepOnePlus实时PCR系统完成实验后，采用2-△△Ct法分析数据。

1.8 Western blot检测PI3K/AKT/ERK信号途径相关蛋白的表达

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白含量。样品经变性后，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，将PVDF膜分别与以下抗体4℃孵育过夜：TRPM7 抗体（1∶1 000）、PI3K 抗体（1∶1 000）、p-AKT 抗体（1∶1 000）、AKT 抗体（1∶1 000）、p-ERK1/2抗体（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）和 GAPDH 抗体（1∶2 000）。PVDF膜用TBST洗涤3次，与 IgG-HRP 抗体（1∶4 000）孵育 1h，TBST 洗涤 3次。显影曝光，采用Image-Pro Plus图像分析系统分析蛋白条带的灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，正态分布数据资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TRPM7在脑胶质瘤细胞系中的表达

qRT-PCR检测结果显示，TRPM7 mRNA在4株细胞系中的表达差异有统计学意义（F=23.05，P＜0.001），进一步两两比较显示，TRPM7 mRNA在3株脑胶质瘤细胞系中的表达量均高于HA1800细胞（P<0.05），见图1A。Western blot检测结果显示，TRPM7蛋白在4株细胞系中的表达差异有统计学意义（F=97.37，P＜0.001），进一步两两比较显示，TRPM7蛋白在3株脑胶质瘤细胞系中的表达较HA1800细胞上调（P<0.01），见图1B。其中U251细胞中TRPM7的表达水平最高（P<0.001），因此选择U251细胞进行后续功能实验。

图1 TRPM7在脑胶质瘤细胞系中的表达Fig.1 TRPM7 expression in glioma cell lines

2.2 TRPM7沉默效果验证

qRT-PCR检测结果显示，TRPM7 mRNA在U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组中的表达差异有统计学意义（F=101.40，P=0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组TRPM7 mRNA表达量均较其余两组降低（P<0.001），见图2A。Western blot检测结果显示，TRPM7蛋白在U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组中的表达差异有统计学意义（F=65.15，P＜0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组TRPM7蛋白表达水平均较其余两组显著下调（P<0.001），见图2B。

图2 转染后U251细胞中TRPM7的表达Fig.2 Expression of TRPM7 in U251 cells after transfection

2.3 沉默TRPM7对U251细胞增殖的影响

细胞克隆形成实验结果显示，U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组细胞集落数目差异有统计学意义（F=31.53，P＜0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组细胞的集落数目均较其余两组明显减少（P<0.01），见图 3。

图3 沉默TRPM7对U251细胞增殖的影响Fig.3 The effect of silencing TRPM7 on the proliferation of U251 cells

2.4 沉默TRPM7对U251细胞迁移、侵袭的影响

Transwell实验检测结果显示，U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组细胞迁移数目和侵袭数目差异有统计学意义（F=45.70，38.21；均 P＜0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组细胞迁移数目和侵袭数目均较其余两组明显减少（P<0.01），见图4。

图4 沉默TRPM7对U251细胞迁移、侵袭的影响Fig.4 The effect of silencing TRPM7 on the migration and invasion of U251 cells

2.5 沉默TRPM7对U251细胞EMT的影响

细胞免疫荧光染色实验结果显示，U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组中E-cadherin和Vimentin阳性表达率差异有统计学意义（F=77.94，35.54；均 P＜0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组中E-cadherin阳性表达率较其余两组增加（P<0.001），Vimentin阳性表达率较其余两组降低（P<0.01），见图 5。

图5 沉默TRPM7对U251细胞上皮-间质转化的影响Fig.5 The effect of silencing TRPM7 on U251 cell epithelial mesenchymal transition

2.6 沉默TRPM7对PI3K/AKT/ERK信号途径相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，U251组、U251/shNC组和U251/shTRPM7组中PI3K蛋白表达水平、AKT蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化程度差异有统计学意义（F=77.94，35.54，35.54；均 P＜0.001），进一步两两比较显示，U251/shTRPM7组中3个相关蛋白的表达水平均较其余两组明显降低（P<0.01），见图6。

图6 沉默TRPM7对PI3K/AKT/ERK信号途径相关蛋白的影响Fig.6 The effect of silencing TRPM7 on PI3K/AKT/ERK signaling pathway-related proteins

3 讨论

手术、化疗和放疗等综合治疗是目前临床上常用的治疗手段，但是难以彻底清除肿瘤组织，肿瘤易复发，患者致残率和致死率均较高，在改善患者生存中的作用有限［13］。近年来随着分子生物学的发展，针对脑胶质瘤特异性的分子靶向治疗也成为研究热点，但是目前尚未找到理想的治疗靶点，而针对脑胶质瘤的分子靶向药物治疗亦尚未在临床得到广泛应用。

TRPM7是非选择性阳离子通道，可渗透Ca2+，Mg2+和其他阳离子，在多种生理过程（包括细胞生长、细胞死亡和发育）中起至关重要的作用［14］。目前TRPM7已在多种肿瘤中进行研究，LUO等［15］在前列腺癌细胞研究中发现，香芹酚可抑制TRPM7表达从而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。李爱迪等［16］报道沉默TRPM7可抑制人口腔颊黏膜成纤维细胞增殖和迁移能力。本研究首先采用qRT-PCR和Western blot检测脑胶质瘤细胞系中TRPM7表达，结果发现TRPM7在脑胶质瘤系中均呈高表达，且在U251细胞中表达量最高。因此，后续利用shRNA转染脑胶质瘤U251细胞构建TRPM7低表达的稳定转染细胞株，进一步进行功能实验，同样发现沉默TRPM7可使U251细胞增殖、迁移和侵袭能力下降。

目前研究已证实EMT在肿瘤细胞侵袭和转移中发挥重要作用［17］。因此认为，有效抑制脑胶质瘤细胞EMT可能是有效治疗脑胶质瘤的关键环节之一。而在多种恶性肿瘤研究中均发现TRPM7可影响EMT。通常在EMT期间，E-cadherin被下调而Vimentin被上调［18］。研究发现，下调TRPM7可抑制卵巢癌细胞EMT，其E-cadherin蛋白上调而Vimentin蛋白下调［19］。在结直肠癌细胞研究中也观察到沉默TRPM7可能通过调节EMT而抑制细胞增殖、迁移和侵袭［20］。本研究同样发现沉默TRPM7可增加E-cadherin表达，并降低Vimentin表达，与上述文献报道一致，提示TRPM7可能在脑胶质瘤中诱导EMT，从而在脑胶质瘤细胞侵袭和迁移中发挥重要作用。

细胞的增殖、迁移和运动往往受到不同的细胞内信号传导途径调节，包括PI3K/AKT途径、ERK途径等［21］。脑胶质瘤中也发现激活PI3K/AKT/Snail、MAPK/ERK和PI3K/AKT等信号通路可促进细胞增殖和侵袭［22-23］。因此，推测TRPM7可能通过以上途径在脑胶质瘤中发挥作用。为此，本研究进一步采用Western blot检测沉默TRPM7后U251细胞中PI3K/AKT/ERK信号途径相关蛋白的表达，结果发现沉默TRPM7使PI3K蛋白表达水平明显下调，AKT和ERK1/2蛋白磷酸化程度也明显降低，说明该途径被激活，同时可能调节了E-cadherin和Vimentin蛋白的表达，从而抑制EMT。

综上所述，TRPM7在脑胶质瘤细胞系中表达上调，沉默TRPM7可抑制U251细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，可能与激活PI3K/AKT/ERK信号途径有关。TRPM7可能是脑胶质瘤候选的预后生物标志物和潜在的治疗靶标。