POLB基因在动物上的研究进展

李玉龙，翟亚莹，吕世杰，于 翔，朱肖亭，张志杰，张格阳，张子敬，施巧婷，陈付英，徐照学，王二耀*

(1. 河南省农业大学动物科技学院， 郑州 450002；2. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所， 郑州 450002;3. 河南省动物卫生监督所，郑州 450003.)

DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，POLB)属于DNA聚合酶X家族中的一员，为Weisssbach等[1]在1971年首次发现。该家族成员还包含Polλ、Polμ以及末端转移酶TdT等[2]。其主要功能是参与碱基切除修复(base excision repair,BER)系统对DNA损伤进行碱基的切除以及修复。脱氧核糖核酸(Deoxyribonoulecic acid，DNA)是携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传物质，是生物体发展发育和正常运转必不可少的生物大分子，DNA分子的稳定性对机体很重要，它是机体内各项生命活动的基础。但是，细胞内的DNA分子却常常受到机体内源性与外源性的各种有害信号的诱导致使DNA损伤。DNA损伤在细胞中如不能得到有效修复，易导致细胞的衰老、凋亡以及癌变等后果[3]。Wang等[4]研究证明，POLB在细胞周期调控中起着重要作用。由于POLB表达下降使得上述的癌基因、抑癌基因(如ras、p53和Rb等)受到损伤后却不能得到正确修复，从而导致细胞周期的紊乱、增殖失控。因此，进一步深入探讨POLB在细胞周期调控机制中的作用，为畜禽品种的改善并开发新的分子辅助标记具有非常重要的意义。

1 POLB基因的结构

在人体中POLB基因定位在第8号染色体的第P11-P12区，该基因横跨范围长达14个外显子和13个内含子[5]。POLB蛋白分子质量只有39 KD，是真核细胞中最小的DNA多聚酶[6]。从结构上看，人和啮齿动物POLB蛋白由335个氨基酸组成，在蛋白二级结构中由螺旋(10%)和β片层(50%)组成[7-8]。POLB包含两大重要的结构域：8 KD的N-末端和31 KD的C-末端，N-末端具有5′-脱氧核糖磷酸裂解酶功能和单链DNA结合功能，C-末端具有双链DNA聚合酶催化功能[9]。进一步研究发现，C-末端分为三个亚区，一个“指部”亚区、一个“掌部”亚区、一个“拇指”亚区。另外，在N-末端内有一个称为螺旋-发卡-螺旋(helix-hairpin-helix,HhH)的结构，此为POLB蛋白与DNA作用的重要区域[10]。1981年，Tanabe 等[8]人从多种哺乳类动物细胞中提取POLB蛋白并测定其分子量和分子结构，结果发现POLB蛋白在的中细胞中的分子量和分子结构大致相同。Chang等[11]也研究发现POLB在哺乳类动物中的同源性以及在结构进化过程中相当保守，说明其在哺乳类动物中功能相似。

2 POLB基因的生物学功能

2.1 POLB基因参与DNA损伤修复

POLB基因参与碱基切除修复(Base excision repair，BER)主要发生在细胞核中。POLB位于BER修复过程的中心位置，起关键作用。POLB功能性研究结果显示，细胞内POLB表达量下降以及其表达产物活性降低，都将致使BER效率减弱，随着BER效率的减弱细胞对DNA损伤试剂的敏感性也越来越大，进而导致细胞凋亡。POLB的主要功能是拥有DNA 聚合酶活性，除此之外，POLB还可以切除被APE1切割而形成的5′-d RP基团，这是其发挥了 5′-d RP裂合酶活性的作用。但是，POLB没有 3′-5′位点的核酸外切酶活性，这导致DNA的突变率大大增加，其原因是其无法及时矫正错配的碱基[12]。POLB基因缺失、突变或功能的异常往往导致 DNA 损伤修复功能缺失[13-14]。进而细胞内受损伤的 DNA 来不及被修复，基因的不稳定性也将提高，从而致使细胞毒性以及突变产生[15]。另外，POLB能跨碱基AP位点(无嘌呤或无嘧啶位点)修复导致缺失及碱基置换型突变，成为保真度最低的DNA聚合酶。P53依赖性DNA的修复或凋亡的触发取决于受损DNA积累的程度[16]，P53之所以能够直接识别DNA损伤位点(包括BER位点)信号并与其结合，那是因为P53与含有1个或4个核苷酸缺失的DNA亲和力最强。P53蛋白结构的核心位置和其N-末端都能对BER产生影响，P53通过其N-末端与POLB蛋白相互作用。

2.2 POLB蛋白与支架蛋白结合发挥功能

参与BER 过程中的修复酶类，只能和DNA受损伤位点结合方能发挥其修复功能，而支架蛋白能够将这些修复酶类送到DNA受损伤的位点，并为酶促反应提供条件。增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclera antigen，PCNA)是一种重要的支架蛋白，其与DNA合成和细胞增殖息息相关，在细胞有丝分裂周期中，PCNA在细胞分裂的G1后期(第一间隙期)和S期(DNA合成期)被合成，所以PCNA的表达量与细胞增殖关系密切，并能够在客观上反映细胞的增殖特性[17]。然而近年来，大量的证据表明 PCNA 蛋白能够和多种蛋白结合并且还能够参与到多条细胞代谢通路过程中去，其中包括细胞周期调控、DNA甲基化、DNA损伤修复等[18]。若POLB上的第137位精氨酸突变，PCNA与POLB的结合能力明显降低且影响DNA的修复能力[19]。转基因小鼠研究表明，有R137Q突变体的小鼠细胞其BER 效率会下降且对外源DNA损伤剂抵抗力下降[20]。随后 Wilson[21]团队发现多聚核糖基化聚合酶1( Poly (ADP-ribose) polymerase 1 ,PAPR1)，并发现其与POLB结合成复合物直接影响 BER。另外研究发现，PAPR1 与POLB结合后，还能够通过改变POLB的聚合酶活性也能影响 BER[22]。

2.3 POLB蛋白被翻译修饰后的功能

POLB被PKC磷酸化会造成POLB聚合酶活性丧失[23]。蛋白质精氨酸甲基转移酶6 (protein arginine methyltransferases 6,PRMT6)与蛋白质精氨酸甲基转移酶 1 (protein arginine methyltransferases 1,PRMT1) 都会对POLB进行甲基化修饰，然而，两者对POLB修饰的位点和影响的功能有所不同。PRMT6 对POLB甲基化修饰能够显著提高POLB聚合酶活性，其甲基化的位点为POLB蛋白第 83 位和 152 位的精氨酸[24]。PRMT1对POLB甲基化修饰后，并不能改变POLB自身的 dRP 活力和聚合酶活力，而是阻碍了 PCNA 和POLB的结合，从而降低了DNA的修复能力，其甲基化位点在POLB第 137 位[25]。

2.4 POLB基因参与生长发育的调控机制

肿瘤细胞之所以能够无限增殖，其原因是刺激细胞生长信号通路异常，导致信号分子过度表达或诱导凋亡的通路失活，从而引起细胞的转化、增殖、抵抗细胞凋亡、促进细胞存活。人类、牛和啮齿动物POLB基因的启动子似乎主要是由与cAMP反应元件(Cycli-AMP response element,CRE)结合的蛋白质调控的，其中CREB/ATF家族(包括CREB、ATF1/2、CRèME-1等)能与CRE识别，促进POLB表达[26]。CREB的转录活性受多种信号转导通路的调控，经典的调控通路有cAMP-PKA-磷酸化CREB、有丝分裂原激活的蛋白激酶通路(Ras-Raf-MAPK)、P38通路等[27]，CREB可促进基因转录表达，这与细胞的增殖、生长和分化等密切相关[28]。蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在细胞信号传递中扮演者重要角色，其能够调节细胞的生长和增殖，cAMP反应元件结合蛋白就是PKA重要的下游转录因子。研究发现在食管癌细胞EC9706中PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路处于激活状态，两者共同促进POLB的表达，如果PKA和p38MAPK信号传导途径被抑制剂干扰或阻断，细胞中POLB表达量同样也会受到抑制，从而导致细胞的增殖受阻、细胞的凋亡数量增加，对化疗药顺铂的敏感性也增强[29]。朱艳艳[30]利用甲基苄基亚硝胺(n-nitroso methylbenzylamine，NMBA)分别诱导POLB敲除与对照组的小鼠食管上皮组织，经mRNA转录组芯片以及差异基因富集分析结果显示，有33个基因与细胞增殖调控相关，有27个基因与细胞周期调控相关，其中涉及到PI3K-AKT、MAPK-ERK、PLK1/CENP-A[31-32]等信号通路。任潇毅等[33]采用RNA干扰技术抑制乳癌细胞MC F-7细胞中的POLB的表达，细胞的增殖和侵袭能力均受到显著抑制。这与沈亮[34]的研究结果一致，其还认为POLB可能通过P13K/Akt信号通路对乳腺癌细胞的增殖和迁移进行调控。

小RNA(microRNA, miRNA)是一类单链非编码 RNA分子,长度通常仅有18～24 bp，其可以与靶信使RNA特异性结合,进而影响基因在转录和翻译水平过程中的表达,发挥其生物学效应[35]。POLB能够通过调控miRNA进而调节细胞周期。李嘉欣[36]研究发现，POLB通过调控miR-10b和miR-181b进而调节cyclinA/CDK2影响细胞周期。王媛媛[37]研究表明，POLB可能是miR-499的作用靶点且miR-499与POLB结合，对EC9706和人食管癌细胞系KYSE30细胞有增殖抑制、凋亡促进作用。张满[38]等研究显示，上调食管癌细胞 EC9706 中 miR-149 的表达可下调POLB的表达。上调 miR-149-5p 的表达还可抑制肾癌细胞的增殖和迁移,并促进细胞凋亡[39]。

3 POLB基因在动物方面的研究进展

目前关于POLB在动物方面上的研究国内外鲜有报道。Pan等[20]通过POLB基因Rl37Q位点突变的转基因小鼠与正常同种的小鼠对比，统计分析发现，POLB基因含有突变的胚胎发育至15.5 d、17.5 d和19.5 d的体型和体重都显著低于对照组野生型小鼠的胚胎，同时，利用胚胎成纤维细胞(MEFs)进行细胞水平上的验证，结果显示POLB基因含有R137Q位点突变的细胞存在更高的凋亡比例。也有专家研究发现，POLB基因在MyoD缺失小鼠与正常小鼠的肢体肌肉中差异表达，表明POLB基因可能与的表达与肌肉发育相关[40]。但是POLB基因通过什么生物学途径影响牛肌肉发育仍然需要进一步研究。

4 展望

综上所述，POLB基因在癌症中研究的较多，但其与细胞的周期调控息息相关，推测其与动物的生长发育有一定联系，其在肌肉细胞中的调控机制尚不清楚。POLB基因也是近期我们实验组利用选择性清除从郏县红牛和安格斯牛筛选出来的在生长发育差异显著的候选基因，目前正在进行细胞验证。希望能为郏县红牛快速扩繁提供理论基础。