郏县红牛繁殖技术的研究进展

张志杰，李玉龙，翟亚莹，张格阳，朱肖亭，于 翔，张子敬，吕世杰，施巧婷，陈付英，徐照学，刘 凡*，王二耀*

(1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所, 郑州 450002; 2. 河南省动物卫生监督所， 郑州 450003)

郏县红牛是我国八大地方优良黄牛品种之一，主产区位于河南省平顶山市的郏县。郏县红牛具有体格较大，较为温顺，肌肉丰满，耐粗饲，遗传性能较为稳定等优良特点，具有肉用体型的基础[1]。但是由于其存在着生长发育缓慢等缺点，且随着农业机械化水平的提高，其役用性能持续弱化。再加上国外优良肉牛品种的引进，郏县红牛的效益降低，许多养殖户弃养郏县红牛，导致其种群数量持续下降，许多宝贵的基因丢失，母牛群体不再能满足相关产业发展的需要[2]。因此，对郏县红牛进行品种保护势在必行。

动物繁殖技术是生物技术的一个分支，自上世纪五十年代人工授精技术的应用开始，动物繁殖技术翻开了新的篇章。而作为最重要的家畜之一，牛的繁殖技术在过去的五十年中也取得了长足的进展，包括同期发情，体外受精、超数排卵等技术，对养牛业的发展起着至关重要的作用。繁殖技术在郏县红牛上的成功应用，对郏县红牛品种的繁育至关重要，有助于建设郏县红牛的胚胎基因库，起着品种保护和扩繁的作用。

1 同期发情技术

自然状态下，牛只发情时间分散，对其进行发情鉴定和配种会耗费大量的人力和物力，且后代出生时间不整齐，不利于牛场规模化的生产[3]。世界各国早在上世纪60年代就开始了同期发情的相关研究，并且在牛的品种改良中获得了巨大的成功，我国在70年代时，也开始了相关研究。

同期发情在实践及生产中常用于提高母畜繁殖率，以达到牲畜的生产管理水平。一般促使母畜同期发情的方法分为人为延长其黄体期和人为缩短黄体期两种。可应用的激素种类非常多，包括孕激素、前列腺素、促性腺激素释放激素等，其处理的方法也不同，不同处理方案的效果有着显著差异。在探究郏县红牛同期发情技术方面，李志刚等[4]运用两种同期发情方法处理郏县红牛，发现CIDR+PG法处理的同期发情率显著高于PG法二次处理。但二次PG法操作简单，且性价比高，综合来看，2次PG法更具有实际操作意义。有研究表明，除了激素种类外，季节和母牛是否经产等因素，对于母牛同期发情的效果也会有一定影响。肖杰等[5]运用四种常用的同期发情方法对郏县红牛进行处理，结果发现，CIDR+PG法和2次PG法处理的效果最好。而在夏秋季(5～10月份)和冬春季(11～4月份)对郏县红牛进行同期发情处理结果显示，夏秋季的同期发情率(60%)显著低于冬春季(78%)；在各种处理方法中，经产牛的同期发情率都高于育成牛，但是二者的差异并不显著。

同期发情可以充分发挥母牛的生产潜能，使后代犊牛年龄整齐，可节省在人力、物力、时间等多个方面所投入的成本，使得牛场的规模化、集约化成为可能，极大的提升了养殖场的生产效率[6-7]。另外，同期发情也是建立胚胎基因库的关键技术之一，对于郏县红牛的保种和开发利用，有着举足轻重的作用。

2 超数排卵技术

超数排卵(简称超排)是在母牛发情周期的一定时间给予外源性激素处理，使一头母畜一次排出比自然情况下多几倍到十几倍的卵子的过程称为超数排卵。1927年，国外科学家首次在小鼠的试验中发现了超数排卵现象，这项技术随之在各种动物中进行尝试，在1940年时，首次进行了牛的超数排卵。其主要原理是利用超过畜体正常水平的外源性促性腺激素，刺激家畜体内即将转化为闭锁卵泡的有腔卵泡都继续发育至成熟而排卵。在超数排卵过程中，用到的生殖激素可大致分为促性腺激素、孕激素和前列腺素三类，由于不同的激素在家畜体内的半衰期不同，其超排效果也不尽相同。

超排技术发展迅速，在水牛和奶牛中已经得到广泛的应用和推广，也为地方肉牛品种的应用打下基础[8-9]。但是不同的肉牛品种对于超数排卵的结果会有一定的影响[10]，为了探索超数排卵技术在郏县红牛中的应用效果，建立对郏县红牛来说相对稳定、有效的超排程序，和小娥等[11]及李志刚等[4]运用连续4 d递减肌注射FSH法对郏县红牛进行超排处理，头均获可用胚数分别为4.53枚和4.28枚，这些结果表明，试验中所采用的超排方法在郏县红牛上的应用是完全可行的。

除了牛的品种外，超排激素的剂量、品牌以及供体类型，对超排结果都会有一定程度的影响。肖杰[12]研究发现，运用两个不同来源的FSH分三个剂量组280 mg、300 mg、320 mg进行试验，加拿大FSH和宁波产FSH分别在30 mg和320 mg处理郏县红牛时可获得最佳头均黄体数、头均获胚总数和头均可用胚数，且二者间的差异不显著。而育成牛的头均黄体数、头获胚胎总数显著低于经产牛，但可用胚数两者间差异并不显著，这表明郏县红牛的育成牛可作为供体牛进行超数排卵，其提供的可用胚占比例较高。

在实际操作过程中，为了最大化的利用郏县红牛优质供体牛，经常会对其进行重复超排，王新庄等[13]对供体牛进行的3次间隔70 d的连续超排中，超排的效果无显著变化，但在第三次超排中需要适当增加超排的剂量。王新庄等[14]另一项研究结果显示，季节因素对牛的超排效果也会有一定的影响。郏县红牛的超排效果在冬春季(11月～4月)最好，所获得的头均胚总数(7.23个)和头均可用胚总数(6.51个)显著高于夏秋季(4.57个和2.90个)，说明温度及光照对郏县红牛的超数排卵会有一定的影响。

郏县红牛生长较为缓慢，产犊量较少，对于种群的扩繁非常不利。超数排卵在郏县红牛中的应用，可以极大提高优良母畜的利用率，提升繁殖效率，对于快速扩大郏县红牛的种群数量有着巨大作用。

3 体外受精技术

体外受精技术作为家畜繁殖技术领域上的第三次革命，从1959年第一胎体外受精小兔的诞生[15]，到八十年代在家畜上的成功应用，其发展非常迅速。1982年，世界首例试管牛成功诞生[16]，标志着体外受精技术在牛的应用上迈出了巨大的一步。我国动物体外受精技术起步晚，但是发展迅速，在1990年左右得到了第一批试管犊牛，到现在我国牛的体外受精技术已经达到了世界先进水平。

牛体外受精技术应用广泛，其目的主要是为了增加肉牛母体的受孕率，大致分为卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能和体外受精三部分。田万强[17]通过试验证明，20～24 h是郏县红牛卵母细胞体外成熟的最佳时间范围。在郏县红牛细胞培养液中添加10%ECS或者10%FCS与外源激素的联合培养都是完全可行的，两种方案有着完全一致的培养效果。选择10%ECS可简化操作程序，适用于胚胎生产的商业化。添加5.0 mmol/L咖啡因组精子孵育 30 min 可达到最佳的获能效果，卵裂率达到68.59%、桑囊胚率达到 28.50%。但由于咖啡因在帮助精子获能的同时，对胚胎会有一定毒害作用，因此，要尽量减少卵母细胞在受精液中的停留时间。

体外受精技术作为一项重要的繁殖技术，可以与超排以及胚胎冷冻技术联合在郏县红牛中应用，可显著提高优质母畜的利用效率，快速扩繁出优质畜群。

4 胚胎冷冻技术

胚胎冷冻技术是指采取特殊的保护措施和降温措施，使胚胎在超低温(液氮-196 ℃或者-269 ℃)条件下暂时停止代谢，在升温之后能够重新恢复活力的一种保存胚胎的技术。体外受精后没有及时移植的胚胎，可通过常温保存、低温保存和冷冻保存等方式进行存储[18]。作为重要的辅助生殖技术，胚胎冷冻技术在大部分哺乳动物中都有应用，1973年首次在牛中获得成功，至今已经比较成熟。

目前，冷冻牛的胚胎时大多选择甘油或乙二醇作为冷冻保护剂[19],相比其他保护剂如DMSO(二甲基亚砜)来说，保护效果更好且毒性相对较小。有资料显示，冷冻方法及动物品种的不同，对于保护剂的浓度选择也不同。肖杰[12]对郏县红牛的冷冻胚胎方法进行研究，发现在受体牛条件相同的情况下，运用1.5 mol/L乙二醇和2.0 mol/L的甘油冷冻后胚胎的继续发育率之间无显著差异，但选择甘油作为保护剂对于技术的要求相对较低，在运用甘油作冷冻保护剂对郏县红牛胚胎进行冷冻时，2.0～2.5 mol/L的浓度比较适宜。

胚胎冷冻技术使得郏县红牛的胚胎可以进行存储、远距离运输以及胚胎大面积应用移植成为可能，对于郏县红牛胚胎基因库的建设具有极大的理论和实践意义。

5 体细胞克隆技术

通过将一个二倍体细胞核移入去核卵细胞，使其在特定条件下进行重组，然后植入代孕母体中发育成新个体的技术称为体细胞克隆技术[20]。作为一项辅助繁殖技术，自首例细胞克隆绵羊诞生以来，克隆技术便以其无可比拟的优势在畜牧业的生产中发挥着巨大作用，具有广阔的应用前景[21]。2003年，我国首次利用克隆技术生产了3头克隆牛[22]，标志着我国在克隆技术运用于牛的生产上迈出了巨大的一步。

尽管克隆牛所需要的细胞核来源非常广泛，且目前核移植的平均效率已经有了很大提升，但是其变异仍然较大[23]。变异的来源包括核源的核型和供体细胞的处理等[24]。楚秋霞[25]等对郏县红牛耳成纤维细胞进行培养及传代的过程中，发现细胞的活力损害较小，且染色体和核型保持了一定程度的稳定性，可以作为郏县红牛体细胞克隆的材料来源。

由于克隆技术所需的苛刻环境和技术条件，具有高昂的成本，目前其并不具备规模化生产的技术价值。且克隆技术目前存在着克隆效率低[26-27]，克隆动物胚胎，胎儿发育异常如胎儿肥大[28-29]及克隆动物发育缺陷等问题。若要将其运用到郏县红牛的广泛生产当中，还需要进一步的努力，对操作过程进行进一步的优化，使其更加适应工厂规模化的操作[20]。

6 展望

作为优质蛋白质的来源之一，牛肉在国内市场一直处于供不应求的状态。郏县红牛作为地方优秀肉牛品种之一，肉用性能良好，风味独特，但其基础规模群体较小，生长周期较长，繁殖能力弱，限制了郏县红牛产业的进一步发展。同期发情、超数排卵等一系列繁殖技术在郏县红牛集约化养殖中的成功应用，一定程度上改善了这一现状，提高了养殖户的经济效益。同时我们也看到，这些繁殖技术有的并没有很完善，还有很大的改进空间。我们相信，随着这些繁殖技术的进一步优化和更多繁殖技术在郏县红牛上的应用，能够实现郏县红牛优质种群的快速扩繁，在保种的基础上为养殖户增产增收。