黄韧带骨化机制与骨质疏松症治疗策略

常亚南 舒丽 张驰

1.北京大学国际医院中心实验室，北京 102206

2.北京大学国际医院骨科，北京 102206

3.北京大学跨学部生物医学工程系，北京 102206

骨质疏松症(osteoporosis)是最常见的代谢性骨病，其特征是骨量减少、骨组织微结构改变、骨强度降低和骨折风险增加[1]。骨质疏松是因为成骨细胞与破骨细胞之间功能不平衡造成的。调控骨形成和吸收关键通路机制的发现，有助确定具有特异作用机制的新治疗方法[2]。目前大多数骨质疏松治疗药物旨在抑制骨吸收，在机制上是针对破骨细胞。由于骨重建过程涉及骨形成和骨吸收，仅使用抗骨吸收类药物难以有效改善骨量及骨结构，为了更有效治疗骨质疏松，刺激新骨形成将是重要策略，在机制上针对的是成骨细胞。目前临床上还没有能直接刺激新骨形成的药物，阐明骨形成过程的基因调控分子机制对指导骨质疏松特异性促骨形成新药的研发有重要意义。

骨形成包括膜内成骨与软骨内成骨两种方式，膜内成骨是先由间充质细胞分化成为胚性结缔组织膜，然后在此膜内成骨，颅面及锁骨即以此方式形成；软骨内成骨以预先形成的软骨为模板然后被骨组织取代的过程为特征，远较膜内成骨复杂，大多数骨如四肢、躯干及颅底骨以此方式形成。成骨细胞从间充质干细胞分化而来，经历了由不同转录因子及信号蛋白调控的多个阶段。Ihh是软骨内成骨所必需的转录因子，不参与膜内成骨，它对间充质细胞分化为成骨细胞必不可缺；转录因子Runx2参与软骨内成骨及膜内成骨调控，表达Runx2的细胞能分化为成骨细胞或软骨细胞；成骨细胞特异转录因子Osterix(Osx)是骨形成及成骨细胞分化的必要转录因子[3]，Osx基因缺失小鼠胚胎完全没有骨形成而软骨形成不受影响。本课题组前期研究已经发现了一些重要的Osx下游靶基因，包括VDR、SatB2、VEGF、Dkk1、Sost等，进一步确认了Osx对骨形成的重要作用[4]。Osx直接调控成骨细胞标志基因骨涎蛋白(Bsp)[5]。全基因组关联分析研究证实Osx与骨质疏松相关[6]。虽然Osx与骨质疏松症表型有关，但仍需进一步研究以确定Osx在骨形成作用的分子机制，包括探索Osx上游调节因子。治疗骨质疏松症迫切需要促骨形成新药，Osx作为骨分子开关是理想的新靶点。而临床上的另一种骨病为寻找 Osx上游调节因子提供了很好的参考，那就是黄韧带骨化(ossification of the ligamentum flavum，OLF)，由于尚未明确的病理性原因在骨外组织黄韧带里刺激了新骨的形成。

1 黄韧带骨化

黄韧带是脊柱椎管内维持脊柱稳定性的一个韧带组织结构。黄韧带主要由弹力纤维、胶原纤维、网状纤维和细胞基质组成[7]。OLF属于脊柱韧带病理性异位骨化性疾病，颈椎、胸椎和腰椎均可发生，其中最常发生在胸椎尤其是下胸段部位(T9～T12)[8-10]。OLF的病理学特征属于软骨内成骨过程[11]。其组织病理学变化为：弹性纤维变性、降解；胶原纤维大量增生，局部成纤维细胞分化形成软骨细胞，进而分泌软骨基质形成软骨；随后软骨发生钙化，新生血管长入，局部的间充质细胞分化为成骨细胞，最终分泌骨基质，形成成熟骨组织骨化。

胸椎黄韧带骨化(thoracic ossification of the ligamentum flavum，TOLF)以胸椎的黄韧带异位成骨为特征，被认为是胸椎椎管狭窄和脊髓病的主要原因，会导致脊髓、神经受压。在TOLF 早期未压迫脊髓时无明显症状，而压迫脊髓后常表现为双下肢僵硬无力、间歇性跛行、腰背部疼痛或并发下肢疼痛，其起病隐匿，但一旦出现胸脊髓压迫运动神经导致其功能严重损害时，致瘫率极高[12]。

2 黄韧带骨化流行病调查

流行病学调查显示，OLF发病具有明显种族差异、性别差异和家族性倾向。OLF主要发生于亚洲人群，集中于中、日、韩等国家，而欧美及非洲相对较少[13-15]。种族差异提示OLF可能与某种遗传因素相关。OLF被视为中老年性疾病[16]，有研究显示其平均发病年龄为61岁，男性多于女性。当亚洲人年龄超过65岁后，OLF发病率可高达至20%，然而对于欧美人群发病情况则少有报道。在一项对中国南方1 736名志愿者进行的研究中发现，3.8%的志愿者患有TOLF，但无明显症状[8]；另一组研究对993例因存在胸部症状而就诊患者的CT结果进行了分析，发现重建胸椎后有63.9%的患者为没有明显椎管狭窄的TOLF[9]。明确何种类型及程度的TOLF会引起脊髓损害是临床诊断的关键和难题。

3 黄韧带骨化治疗现状

外科手术减压是目前对于TOLF所引起的胸椎椎管狭窄唯一有效的治疗方法，然而多种手术常见并发症如脊髓或神经根损伤、硬膜外血肿形成、硬脊膜损伤及脑脊液漏、术后脊柱失稳甚至后凸畸形等仍然给临床治疗和患者预后造成巨大困难，最严重的是术中脊髓损伤或术后血肿导致患者术后截瘫。许多患者就诊时病情已较重，至今仍无有效的非手术治疗方法和早期诊断手段。

4 黄韧带骨化致病机制

OLF致病机制尚不清楚。据报道OLF发生与多种因素相关，如力学因素、遗传因素、内分泌以及微量元素等，这些因素尚难以明确阐明OLF发病机制。

4.1 力学因素

研究显示力学异常在OLF 发生发展中起重要作用。Maigne等[17]对胸椎黄韧带附着部位的骨化进行了研究，发现关节突关节的旋转幅度与OLF发生频率呈正相关，这表明旋转应力对OLF起重要的作用。有研究报道了OLF发生于年轻棒球投手的病例，发现在患者胸腰椎交界处单边左侧OLF压迫脊髓，同样证实了反复局部的旋转机械应力可能促使OLF。研究发现胸腰椎后凸畸形的患者OLF的发生率较高，提示作用于黄韧带的局部机械应力会促进骨化的发生发展。细胞学研究发现机械应力会促进黄韧带细胞的成骨进程。Fan等[18]对TOLF细胞进行体外拉伸诱导，发现Runx2、Osx、ALP的表达增加，提示机械应力可诱导黄韧带细胞成骨分化从而促进TOLF。研究[19]发现作用于OLF细胞的周期性拉伸应力可通过β-catenin信号途径激活其骨化。Kim等[20]研究脊髓von-Mises应力和横截面积对脊髓压迫的不同程度和形状的影响，发现当脊髓横截面积减少30%～40%或压缩4 mm发生形变时，会出现脊髓症状。

虽然关于机械应力的研究相对较多，但仍无法解释所有病例的致病机制，对于欧美、非洲等地关于机械应力导致OLF的报道较少。脊柱局部应力的异常影响对解释OLF致病机制有其局限性。

4.2 遗传易感基因

流行病学研究表明OLF主要发生在亚洲人群且有些患者具有家族倾向性，这些表明OLF可能与遗传相关[17]，研究已报道易感基因在OLF中起重要作用[21-22]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)因其在人类基因组中分布广泛、遗传稳定性强、富有代表性、易于基因分型和快速自动化分析等特点，已作为易感基因和疾病遗传因素研究的重要方法[23-24]。

4.2.1Runx2 基因：Runx2是参与成骨细胞分化所必需的关键因子。Runx2调节成骨细胞向成骨分化，促进骨组织形成和重建，同时促进多能干细胞向软骨细胞分化。有研究发现Runx2中两个位点RS1321075和RS12333172在OLF患者和对照组之间有所不同，其中一个单倍型的位点表明与OLF的发病率增加有关[25]。使用成骨培养基诱导培养韧带细胞的研究发现Runx2表达增强，同时软骨形成因子如结缔组织生长因子和软骨寡聚基质蛋白以及血管生成素1都显著升高，加入Runx2 siRNA后这些基因表达均受到抑制，而非骨化对照组细胞没有这些变化，提示Runx2参与异位骨化[26]。

4.2.2骨形态发生蛋白：骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是多功能性生长因子，在成骨过程中具有关键调控作用[27]，研究表明其参与异位骨化[28]。BMP家族有十多个亚型，其中与OLF相关的基因有BMP-2 、BMP-4等亚型[29]。有研究对OLF黄韧带的BMPs及其受体BMPRs进行了检测，发现在骨化灶周围的成熟和不成熟软骨细胞以及离骨化灶较远的纺锤体形细胞和圆形细胞中均存在BMPRs，同时发现BMPRs、BMP-2/-4和成骨蛋白-1/BMP-7的配体均共存于OLF，表明BMPs可能参与促进OLF异位骨化位点的软骨内成骨，且OLF的骨化活动是持续存在[30]。有研究在循环机械应力作用下培养原代韧带细胞，诱导其成骨，发现施加机械应力能显著提高胸椎黄韧带细胞BMP-2 表达[31]。Moon等[32]发现经腺病毒介导的BMP-2 cDNA基因转染后的黄韧带细胞可诱导新生骨形成，促进脊柱融合。Qu等[21]发现存在于TOLF中BMP-2的两个突变体，即c.460C>G:p.(R154 G) (Novo 1) 和 c.584 G>T:p.(R195 M) (Novo 2)，功能测定发现突变BMP-2表达促进成骨标记基因表达和成骨分化，表明遗传因素参与TOLF，由单核苷酸替换导致的BMP-2表达上调可能是TOLF的一种机制。BMP-4在成骨分化中起着重要作用。研究发现患者中BMP-4的两个 SNP 位点 RS17563 和 RS2855532带“T”基因型和等位基因型频率明显高于正常人，提示BMP-4 基因与TOLF相关[33]。

4.2.3COL6A1：Ⅵ型胶原是一种存在于细胞外基质并具有细胞因子活性的纤维蛋白，可促进细胞分化、增值、迁移等，是纤维软骨分化的标志物[34]，也与成骨分化密切相关[35]。Ⅵ型胶原蛋白由 α1、α2 和α3 三条链构成，其中编码α1的COL6A1 基因被认为是日本人群脊柱后纵韧带骨化(OPLL)的易感基因，而OLF和OPLL在流行病学、病因学和病理学上都相似且共存，因此COL6A1很可能是OLF的潜在易感基因。研究发现COL6A1启动子(-572 T)SNP的等位基因频率在OLF患者与正常人之间表现出显著差异，此外由启动子(-572)、内含子33(+20)和内含子32(-29)SNP构成的单倍型的总频率在OLF患者与对照之间也存在显著差异，表明COL6A1可能是汉族OLF的易感基因[22]。然而有学者得出相反结论，发现COL6A1的SNP多态性位点与OLF无明显相关，可能与基因座选择、病例选择以及研究方法差异有关[25]。

4.2.4HLA-DQA1基因：人类白细胞抗原(HLA)系统是最具有多肽性的抗原系统。有报道HLA单倍型与OLF相关[36]，对比分析发现HLA-DQA1*0401同OLF呈正相关，可能与OLF易感性相关，DQA1*0201与OLF则呈负相关，可能与OLF抗性相关，表明在HLA-DQA1位点存在易感和抵抗双重作用，这可能是影响OLF发病的因素之一。但该研究样本量较小，该基因和OLF的相关性有待进一步核实。

4.2.5成纤维细胞生长因子：成纤维细胞生长因子(FGF)及其受体FGFR在骨骼发育中起重要作用，调控成骨细胞增殖、分化和凋亡，其中FGF2是骨和软骨分化的重要调节因子[37]。直接测序法对患者和对照者的FGF2、FGFR1、FGFR2和SNP之间的关系进行了对照研究，结果发现FGF2的rs 1476217多态性位点与OLF相关[38]。基因多态性SNP与OLF的相关性研究有助于发现OLF易感基因。但是现在关于OLF易感基因的研究仍然处于探索阶段。对于同一基因同一位点的SNP相关性研究分析，不同学者的结果存在一定差异，其原因可能涉及多因素，因此开展大样本量研究有利于发现OLF易感基因位点。

4.3 内分泌因素

相关研究发现内分泌代谢异常可能与OLF有关。患有糖尿病、肥胖症、氟骨症、钙磷代谢异常等疾病的患者更易发生OLF。研究发现在糖尿病小鼠中TOLF发生率较高，推测高血糖所致胰岛素样生长因子升高可能与OLF有关[39]。瘦素是一种由脂肪组织分泌并参与体内糖、脂肪、能量代谢的肽类激素，也参与骨骼的形成。研究发现女性骨化患者体内瘦素受体表达高于对照女性，提示瘦素可能与韧带骨化的发病相关[40]。其他学者亦证实瘦素与OLF相关，实验发现STAT3、Runx2和类固醇受体共激活因子1是介导瘦素刺激TOLF的影响分子，解释了患有高瘦素血症的肥胖人群容易发生OLF[41]。尽管内分泌代谢异常可能会引起OLF，但是研究报道较少，缺乏大量病例，仍待进一步研究。

4.4 微量元素

微量元素异常可能与OLF有关。有报道表明骨骼氟含量超标可引起OLF[42]。实验提示氟化物可能通过刺激退变黄韧带细胞向成骨细胞分化、成熟，而且在诱导黄韧带退变基础上进一步骨化[43]。Wang等[44]对OLF黄韧带组织中微量元素进行了提取定量分析，发现Ca、F、Zn、Mn、Mo等含量上升，而Cu含量降低，提示微量元素变化可能参与OLF 。有研究表明基础代谢元素水平与TOLF相关[43]。这些元素对OLF的影响机制尚不清楚。

4.5 Notch信号通路

Notch 是介导细胞信号转导的受体蛋白，影响成骨细胞增殖、分化和骨化[45]。研究发现OLF黄韧带细胞在成骨分化期间JAG1、Notch2、HES1上调，而Notch2过表达会促进黄韧带细胞的成骨分化，表明Notch参与OLF，Notch可能通过与Runx2和Osx相互作用影响黄韧带细胞的成骨分化[46]。

4.6 miRNA

miRNA是一个重要的单链非编码RNA家族，在多种生理和病理过程中发挥着重要作用。研究发现miR-132-3p通过FOXO1、GDF5和SOX6抑制黄韧带细胞成骨分化[47]。其他研究发现在黄韧带细胞成骨分化过程中miR-615-3p表达降低，miR-615-3p可以通过转录后抑制成骨调节因子GDF5和FOXO1达到负调控黄韧带细胞成骨分化的目的[48]。最新研究发现miR-490-3p在胸椎黄韧带细胞成骨分化过程中表达下调，而miR-490-3p的过表达抑制了成骨分化。该研究揭示miR-490-3p通过靶向FOXO1抑制成骨分化参与胸椎黄韧带骨化过程[49]。

4.7 新方向机制-炎症因子

近年来，炎症过程对新骨形成的影响越来越受到重视。骨折后观察到一个严格控制的炎症期，它触发修复级联反应，对骨重建至关重要[50-51]。转基因动物模型已经表明肿瘤坏死因子α(TNF-α)在骨折愈合中的重要作用[52]。这表明肿瘤坏死因子-α参与促进出生后骨折修复，骨骼组织发育和出生后修复过程受不同机制的高度调控。异位骨化和一些骨形成过多的疾病显示在炎症期之前[53]。研究显示炎症因子Cox2参与了TNF-α的调控[54]。但炎症因子对TOLF的影响尚不清楚。

本课题组前期通过使用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术对TOLF黄韧带中的蛋白质进行了检测[55]，其中有282种差异表达的蛋白质，功能聚类分析显示上述蛋白质中有十种与炎症有关，包括肿瘤坏死因子(TNF)。ELISA验证患者血清TNF-α含量显著高于对照组，进一步实验发现TNF-α能够诱导黄韧带细胞中Osx的表达，表明它可以促进成骨细胞分化，同时可激活Osx下游的成骨细胞基因OCN和ALP。

TNF主要参与炎症反应、免疫应答以及抗肿瘤等过程，家族成员主要有 TNF-α、TNF-β和TNSF14等。其中TNF-α是一种由单核巨噬细胞分泌的涉及多种疾病发病机制的促炎症细胞因子，对成骨分化有双重作用[56-57]。为了探索TNF-α对TOLF发病机制的影响，本课题组进行了深入研究[58]，首先通过蛋白质印记再次证实OLF 黄韧带中TNF-α 蛋白水平升高，原代细胞经TNF-α刺激后G1 / S特异性蛋白cyclin D1和c-Myc上调，同时Bmp2和Osx也表达上调，另外ERK抑制剂消除了TNF-α激活Osx的表达活性，提示TNF-α通过ERK途径激活Osx，这表明TNF-α可能通过G1 / S特异性蛋白cyclin D1和c-Myc调控细胞增殖并且通过Osx诱导成骨细胞分化来参与TOLF，这是首次发现TNF-α参与TOLF。

5 小结

尽管对于OLF已有相关报道，但其发病机制仍处于探索阶段。上述所提到的相关因素如机械应力、遗传易感基因、内分泌及微量元素代谢异常，都暂时无法清楚解释OLF的发病机制。由于基因及分子变化往往早于影像学病理表现，如何有效防治TOLF是迄今为止尚未解决的医学难题。对TOLF分子机制的深入研究将为探索其病因及早期诊断提供线索。

前期通过蛋白质组学技术得到的差异表达蛋白质谱提示了炎症因子可能参与TOLF的发生。本研究发现TNF-α通过cyclin D1和c-Myc调控细胞增殖，同时通过Osx诱导成骨细胞分化参与TOLF ，揭示了TNF-α在胸椎OLF中的参与及其可能的机制，这表明炎症成分对TOLF病因的影响。有必要进一步研究以探讨不同炎症因子对OLF和Osx影响及其分子机制，这将使人们在蛋白质水平更全面地认识到OLF 的病理发病机制。OLF可能是个多因素参与的疾病，综合考虑各方面因素的参与及其机制将有助于更全面深入地了解OLF的致病机制。另一方面，通过基于RNA测序的基因表达谱的最新研究表明，血管生成素2 (angiopoietin-2)参与TOLF的发生，该研究也显示血管生成素2促进了Osx的基因表达，是Osx的上游因子[59]。综上，开展对于黄韧带骨化致病机制的研究能够为寻找 Osx上游调节因子、进而研发促骨形成新药提供新的思路。