TGF-β1/Smad4信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓微环境的影响及针刺干预机制

白登彦 王冠 张海军 朱涛 赵志鹏 尹秦 郭小荣

1.西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730000

2.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730000

3.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微结构退化导致的骨质变化、骨脆性增加从而极易引发骨折的全身代谢性疾病[1]。研究[2]发现，OP的发生是免疫系统、神经内分泌系统以及骨髓微环境动态失衡等共同作用的结果。骨髓微环境(bone marrow microenvironment，BMM)由成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞、基质细胞及其产生的细胞外基质和细胞因子等成分组成。BMM能够提供生理屏障，阻断调控多种细胞的分化、凋亡的信号，其变化与多种信号因子存在密切关系，其中Runx 2、PPARγ、TGF-β1、Smad 4是BMM动态平衡的重要指标[3]。TGF-β1/Smad 4信号通路是由转化生长因子β1 (transforming growth factor，TGF-β1)和Smad 4构成。研究[4-5]认为，TGF-β1/Smad 4信号通路对骨细胞的形成、分化及凋亡具有一定的调节作用，但具体机制尚未完全阐明。研究[6-7]表明，针刺能够改善骨微结构，调控BMM，但其是否通过调控TGF-β1 /Smad4信号通路影响OP发病尚未见相关报道。因此本研究拟通过切除雌性大鼠双侧卵巢的方法建立OP大鼠模型，给予电针刺激“肾俞穴”“三阴交穴”“关元穴”及“足三里穴”进行干预，旨在观察针刺对去卵巢大鼠TGF-β1 /Smad4信号通路的干预，并分析其对BMM的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取3月龄SPF级雌性Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2019-0001，适应性喂养1周后开始实验造模。本研究经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，实验过程及操作均遵守国家健康与医学研究委员会(NHNRC)动物道德准则。

1.1.2试剂及仪器：纤毛机械刺激针(NC12775，美国StoeltingCo.)，HANS-200A 电针仪(南京济生)。戊酸雌二醇片(国药准字J20191038，规格：1 mg×21片，拜耳)。Runx2抗体 (批号：XGK100552)，PPARγ抗体(批号：WL01800)，TGF-β1抗体(批号：YS-0086R)，Smad4抗体(批号：XY-0585R)，全部购自美国BioVision；BALP ELISAKit(批号：E202006)、CBF-α1 ELISAKit(批号：E202905)、CTX-I ELISAKit(批号：E202012)、PINP ELISAKit(批号：E202010)、OC ELISAKit(批号：E202014)，均购自江苏江莱生物。Benchmark Plus 酶联免疫检测仪(美国赛默飞世尔科技公司)；实验动物微型CT影像系统(西门子Inveon，德国)；倒置相差荧光显微镜(日本，Olympus)；骨密度仪(韩国osteosys)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与造模：将60只大鼠按照随机数字法分为4组：空白组(A组)、模型组(B组)、针刺组(C组)及雌二醇组(D组)，每组各15只。适应性喂养1周后，除空白组外，其他大鼠均参照文献[8]去除卵巢，建立OP模型大鼠。造模成功后[9]进行干预治疗12周。

1.2.2干预：A、B组大鼠给予等剂量生理盐水灌胃；C组按文献[10]取穴，置于自制鼠袋固定大鼠，暴露针刺穴位，将毫针刺入穴位后，接电针仪，疏密波，刺激强度2 mA，2 Hz/100 Hz，每次15 min，1次/d；D组按照人鼠等效剂量给予戊酸雌二醇50 μg/(kg·d)灌胃，共治疗12周。A、B组大鼠常规饲养，各组大鼠生长环境及饲养条件相同。

1.2.3骨代谢标志物含量测定：将大鼠处死后心脏取血2 mL，置于离心机中，离心半径10 cm，转速3 000 r/min，离心10 min，取上清液，采用ELISA法检测血清中骨特异性碱性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase，BALP)、核结合因子-α1(core binding factor-α1，CBF-α1)、I型胶原羧基末端肽(cterminal type I collagen telopeptide，CTX-I)、I型前胶原氨基端前肽(procollagen type I amino-terminal peptide，PINP)、骨钙素(osteocalcin，OC)含量水平。

1.2.4骨小梁微结构及骨密度测定：采用Micro-CT扫描分离后的各组大鼠右侧股骨远端干骺端。所有标本从股骨远端生长板顶点至皮质部分去掉后为本次兴趣区域(region of interest，ROI)，提取图像资料，用自带骨骼分析软件( advanced bone analysis, ABA ) 测定骨组织相关计量学指标，包括：相对骨体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、连接密度(Conn.D)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、结构模型指数(SMI)。通过骨密度仪分析各组大鼠骨密度(bone mineral density, BMD)变化。所有操作分析均由同一组人完成。

1.2.5TUNEL法检测股骨远端细胞凋亡情况：取各组大鼠股骨组织剪碎后置于4 %多聚甲醛溶液内浸泡24 h，不同浓度乙醇按顺序脱水后，进行切片操作，脱蜡后将标本置于苏木精中进行染色15 min后脱水透明10 min，通过TUNEL试剂盒检测不同组大鼠切片标本中细胞凋亡情况，激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.2.6RT-PCR法检测TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表达：提取各组大鼠股骨远端部分骨组织，使用RNA抽提试剂盒提取不同组大鼠骨组织中总RNA，检测RNA纯度含量后用Takara逆转录试剂盒反转录获取cDNA，应用Primer5.0设计引物序列，RT-PCR法检测各组大鼠不同组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表达量，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参对照，采用 2-ΔΔCt方法分析数据。引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.7Western blot法检测TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表达：将大鼠处死后，迅速取其股骨远端的部分骨组织剪碎，加入RIPA裂解缓冲液放置在冰上30 min，提取各组大鼠骨组织中的总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定各组大鼠骨组织中蛋白质的浓度。蛋白质用SDS-PAGE进行等量分离，然后移至PDVF膜上，并置于4 ℃下添加一抗(1∶500)孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶500)，常温下孵育2 h。ECL试剂显影后应用软件QuantityOne对蛋白相对表达水平进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠骨代谢标志物比较

与空白组比较，各组大鼠造模后骨代谢标志物BALP、CBF-α1、PINP、OC含量明显降低(P<0.05)，CTX-I含量明显升高(P<0.05)；干预治疗12周后，与模型组比较，雌二醇组大鼠和针刺组大鼠BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC改善程度优于模型组(P<0.05)，且针刺组优于雌二醇组明显(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠骨代谢标志物含量比较

2.2 大鼠骨小梁微结构及骨密度比较

与空白组比较，模型组大鼠造模后BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI均出现不同程度改变(P<0.05)；干预12周后，与模型组比较，雌二醇组大鼠和针刺组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI参数不同程度改变(P<0.05)；其中针刺组干预效果优于雌二醇组(P<0.01)。见表3。

表3 大鼠骨小梁微结构比较

2.3 大鼠股骨远端细胞凋亡情况比较

TUNEL染色提示蓝色荧光为正常细胞核，绿色荧光为凋亡的成骨细胞和骨细胞。激光共聚焦显示，空白组大鼠骨组织正常，绿色荧光极少；模型组大鼠造模后绿色荧光增多，提示成骨细胞和骨细胞凋亡增加；干预治疗后，针刺组和雌二醇组大鼠股骨远端成骨细胞和骨细胞凋亡数量减少。见图1。

图1 大鼠股骨远端细胞凋亡情况比较

2.4 大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表达量比较

与空白组比较，各组大鼠造模后股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4 mRNA表达量明显下降(P<0.05)，Runx2、PPARγ mRNA表达量明显上升(P<0.05)；与模型组比较，干预12周后，各治疗组大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4表达量明显上升(P<0.05)，Runx2、PPARγ mRNA表达量明显下降(P<0.05)；其中针刺组和雌二醇组大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA的表达效果优于模型组(P<0.05)，针刺组明显优于雌二醇组(P<0.01)。见表4。

表4 骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ mRNA表达量比较

2.5 大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表达量比较

与空白组比较，各组大鼠造模后股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4 蛋白表达量明显下降(P<0.05)，Runx2、PPARγ 蛋白表达量明显上升(P<0.05)；与模型组比较，干预12周后，各治疗组大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4蛋白表达量明显上升(P<0.05)，Runx2、PPARγ 蛋白表达量明显下降(P<0.05)；其中针刺组和雌二醇组大鼠股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ 蛋白的表达效果优于模型组(P<0.05)，针刺组明显优于雌二醇组(P<0.01)。见图2。

图2 股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ蛋白表达量比较

3 讨论

OP发病原因与骨组织代谢异常、骨髓微环境改变等多种因素有关[11]。随着近几年激素使用过多，人口老龄化加快，OP患者正在逐年增长[12]。中医学将骨质疏松归为“骨痿”“骨枯”范畴，辨证该病时多从肾脾等入手。张介宾[13]指出：“水谷之海先天为之主，精血之海后天为之资……先天不足者，后天培养之，亦可居其强半”。说明肾精气充足与脾胃功能密切相关，脾胃健旺，则水谷精微化源充盛，骨骼强盛。骨髓微环境异常时，肾主骨生髓之功能也异常，进而可至骨痿，正如《素问·脉要精微论》所述“骨者，髓之府，转摇不能，肾将惫矣”，《素问·痿论》言：“肾气热则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”，这也说明“肾将惫”与“肾气热”与脑的生理功能异常存在着密切的联系。针刺能够明显调节骨髓微环境，改善骨微结构，修复成骨细胞增长、改善骨质量，但其具体机制仍不明确[14-16]。研究[17-19]指出，“肾俞穴”“三阴交穴”“关元穴”及“足三里穴”是补肾健脾重要穴位，而且对于OP的发生发展有重要影响。因此，本次研究在此基础上选择了上述穴位。

BMD是目前临床检测骨质疏松变化的重要指标。本研究结果显示，大鼠在卵巢摘除后，其BMD明显降低，骨小梁微结构严重破坏，证明成功建立OP模型。PINP作为I型前胶原细胞外分泌产物是骨形成的敏感指标，CTX-I是骨吸收过程中I型胶原释放入血的产物。血液中PINP及CTX- I含量变化与I型胶原的合成速率、成骨细胞活动情况以及骨吸收过程密切相关，是诊断OP的特异性指标[20-21]。CBF-α1属于Runt结构域基因家族的转录因子，由成骨细胞特异性表达，对成骨细胞的分化的起重要作用。研究[22]指出，CBF-α1能够调节成骨细胞分化，调控骨细胞的功能因子表达，对骨骼形成和发育有重要作用。OC又称骨R-羟基谷氨酸蛋白，主要由成骨细胞、成牙质细胞合成，作为成骨细胞分泌的特殊非胶原蛋白，其含量变化可用于监测骨发育以及骨代谢情况，在调节骨钙代谢中起重要作用[23]。在OP中，CTX-I、CBF-α1以及OC均能特异性反映骨髓微环境平衡情况。本研究发现，与空白组比较，模型组大鼠血清中BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC等骨代谢标志物含量明显改变，这表明去卵巢大鼠造模后骨量出现丢失，这与OP的病理表现相符。与模型组比较，针刺干预后大鼠骨代谢相关标志物水平明显改善，BMD含量明显增加，骨小梁微结构及骨髓微环境明显改善，这与王亚军[24]、邵雨薇[25]等的研究结果一致。

骨髓微环境紊乱与绝经后骨质疏松症的骨代谢特点非常相似，而骨髓微环境平衡是多种因素共同作用的结果[26]。其中Runx2 和 PPARγ能够调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞这两种细胞方向分化，是骨髓微环境动态变化的重要指标因子[27-28]。TGF-β1是调节骨髓微环境中骨吸收和骨形成的重要多肽类生长因子，Smad4是TGF-β1跨膜传导多种信号所需的重要分子之一，TGF-β1/Smad4信号通路在骨髓微环境的平衡调节过程中发挥着重要作用，是绝经后骨质疏松症发生的重要机制[29-30]。但针刺是否通过调控TGF-β1/Smad4信号通路影响OP的骨髓微环境仍不明确。本研究结果显示，大鼠造模后股骨远端骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ表达含量明显改变，但经针刺干预后，骨组织中TGF-β1、Smad4、Runx2、PPARγ趋向好转，这提示针刺能够调节OP大鼠TGF-β1/Smad4信号通路的表达，进而影响OP骨髓微环境改变。

综上所述，针刺能够影响去卵巢大鼠骨髓微环境改变，改善骨代谢标志物表达，调控骨代谢平衡，其机制可能与针刺调控TGF-β1/Smad4信号通路表达有关。