核医学显像探针在肿瘤PD-L1免疫治疗中的应用

杨林超，李文杰，陈楠

0 引言

肿瘤细胞产生免疫逃逸的主要机制之一是免疫T细胞表达的程序化细胞死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）与高表达于肿瘤细胞表面的程序化死亡配体-1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）之间的相互作用，即PPI效应。PD-L1与PD-1结合后会终止免疫T细胞的激活通路，避免T细胞对肿瘤细胞产生杀伤作用[1-3]。自2014年，美国食品药品监督管理局（food and drug administration,FDA）接连批准上市了一系列基于免疫检查点抑制剂，包括靶向PD-1的Pembrolizumab（Keytruda®）、Nivolumab（Opdivo®）和Cemiplimab（Libtayo®），以及靶向PD-L1的Atezolizumab（Tecentriq®）和Avelumab（Bavencio®）等。这些免疫检查点抑制剂类药物在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌以及淋巴瘤等治疗领域发挥了巨大的作用[4-6]。据统计，nivolumab和pembrolizumab在霍奇金淋巴瘤和恶性黑色素瘤患者中的客观响应率分别达到87%和70%，但在非小细胞肺癌和头颈部肿瘤患者中的客观响应率分别只有20%和15%[7]。研究表明，霍奇金淋巴瘤具有独特的免疫抑制机制，能够上调肿瘤细胞PD-L1的表达水平[8]，可能是其对免疫治疗响应程度较高的主要原因。此外，在非小细胞肺癌患者中，肿瘤PD-L1的表达水平也与患者接受PD-L1靶向免疫治疗的获益性直接相关[9]。因此，检测肿瘤组织PD-L1的表达水平，对于筛选可能从PD-L1免疫治疗中获益的患者，以及预测患者对于免疫治疗的响应程度具有重要的临床意义。

1 PD-L1的表达及其检测方法

基于免疫检查点抑制剂的肿瘤疗法在不同患者中引起的治疗响应、毒性以及不良反应等方面存在很大的差异[10-11]。有报道称，接近70%的患者对于该疗法不会产生响应[12]，甚至有部分穿刺活检呈现PD-L1阳性表达的患者，对免疫疗法也没有产生治疗响应[13]。一方面因为传统癌症疗法的评价指标并不适用于进行免疫治疗的患者。接受化疗的患者在早期即可观察到肿瘤体积缩小，而接受免疫治疗的部分患者（2%～14%）在治疗早期（约1月）时会观察到免疫响应引起的肿瘤负荷增加，即疾病的假性进展，而在3月后才出现缓解[14-15]。另一方面，PD-L1在肿瘤中的表达程度也是免疫疗法有效与否的重要的因素。PD-L1已被证实在不同类型肿瘤细胞中均有表达，且会受到炎性因子等刺激而上调其表达水平，存在着表达的异质性[16]。临床试验在以穿刺活检获得的PD-L1表达量作为纳入标准时，其范围往往不固定（5%～50%），且目前使用的PD-L1免疫组织化学染色实验采用的抗体也存在着基于不同的抗原表位等不确定因素[17-18]。此外，穿刺活检进行免疫组织化学染色的方法往往局限于高级别肿瘤患者中[13]。因此，目前尚缺乏一个用于判定PD-L1在肿瘤细胞及肿瘤微环境中的表达水平金标准。

利用核医学分子影像来进行非侵入式的检测PD-L1在活体中的表达水平。目前已有多种PD-L1分子影像探针成功应用于早期临床研究，在免疫治疗的患者筛选、治疗监测、疗效评价等方面存在着巨大的应用价值[19-21]。在此，我们对近年来靶向肿瘤PD-L1的免疫显像探针进行总结，并对一些可能的多肽及小分子类PPI抑制剂在PD-L1免疫显像中的应用前景进行讨论分析。

2 基于单克隆抗体的肿瘤免疫显像探针

应用中长半衰期放射性核素111In（t1/2=2.8 d）、99mTc（t1/2=6.01 h）、64Cu（t1/2=12.7 h）、89Zr（t1/2=78.4 h）等标记单克隆抗体类探针进行正电子发射计算机断层扫描（positron emission tomography/computed tomography,PET/CT）或者单光子发射计算机断层扫描成像（single proton emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT）是目前研究最为广泛的PD-L1显像策略。Heskamp等最先应用111In标记高亲和力的鼠源单克隆抗体PD-L1.1.3（半抑制浓度IC50=0.15 nmol/L）来进行肿瘤PD-L1显像[22]。注射后第3天，111In-PD-L1.1.3在PD-L1阳性高表达的MDA-MB-231肿瘤中可获得最高的探针摄取（36.4±4.0）% ID/g及瘤/血比（T/B=3.1±1.0），而PD-L1低表达的MCF-7肿瘤中探针摄取仅为（7.3±1.0）% ID/g，瘤/血比仅为0.8±0.1。同时，应用111In-PD-L1.1.3进行SPECT/CT显像和放射自显影能够证实肿瘤组织存在着PD-L1表达的异质性。该研究表明111In-PD-L1.1.3可用于区分PD-L1阳性和阴性表达的肿瘤，并首次证明了利用核医学探针对肿瘤PD-L1进行非侵入式体内显像的可行性。

Truillet等利用89Zr标记了一种与人源和鼠源PD-L1的胞外段都具有高亲和力（KD分别为 4.2 nmol/L和0.34 nmol/L）的重组人源化IgG1抗体（89Zr-C4），并考察其在PD-L1显像中的应用价值[12]。89Zr-C4在PD-L1高表达的H1975肿瘤模型中的摄取要高于PD-L1低表达的PC3及A549肿瘤模型。在对免疫治疗有持久响应的一名非小细胞肺癌患者的人源肿瘤异种移植模型中，89Zr-C4的摄取值（～5%ID/g）比热变性处理后的探针高出10倍，证明了89Zr-C4在肿瘤组织的特异性摄取。此外，89Zr-C4还可对化疗所致肿瘤微环境PD-L1表达水平的变化进行显像。在H1975荷瘤裸鼠模型中，多柔比星治疗会降低89Zr-C4的肿瘤摄取（P＜ 0.05），紫杉醇治疗却会使肿瘤的89Zr-C4摄取升高（P＜0.01）。而在荷B16F10肿瘤的C57BL/6小鼠中，尽管紫杉醇治疗可以使肿瘤组织探针摄取升高（P＜0.01），但多柔比星治疗对肿瘤探针摄取无显著影响，提示该探针可用于监测标准治疗所致PD-L1表达水平的动态变化。相比于111In-PD-L1.1.3，89Zr-C4是一种人源化抗体，因此具有一定的临床转化应用前景。

在另外一项研究中，Christensen等利用定点标记技术构建了一种高亲和力的PD-L1靶向探针89Zr-DFO-6E11（Kd=0.23 nM），并用该探针对放疗引起的肿瘤组织PD-L1表达水平的变化进行PET/CT显像[23]。在PD-L1低表达的H1703肿瘤模型中，探针摄取仅为（1.35±0.1）% ID/g，而在PD-L1高表达的HCC827和CT26肿瘤模型中探针摄取显著增加，分别达到（5.1±0.6）% ID/g（P=0.0003）和（8.26±0.6）% ID/g（P＜0.0001）。在接受放疗后，CT26肿瘤组织的探针摄取显著增加（P＜0.01），瘤本比也显著提升（P＜0.001），免疫组织化学也证实了肿瘤组织中PD-L1阳性表达的细胞数量增多。此外，该研究还表明89Zr-DFO-6E11的肿瘤/肌肉摄取比值与治疗响应具有相关性（P=0.0252），提示PD-L1核医学分子探针在治疗监测中的应用价值。

除此之外，FDA批准的PD-L1免疫治疗药物atezolizumab和avelumab也被应用于核素标记来进行PD-L1显像。Lesniak等最早应用正电子核素64Cu及单光子核素111In对atezolizumab进行标记，成功构建了[64Cu]atezolizumab以及[111In]atezolizumab探针，并在动物模型中验证了探针摄取与PD-L1表达水平的相关性[24]。相似地，Jagoda等利用新型正电子核素89Zr，标记另一种PD-L1抗体avelumab，在动物模型中证实了PD-L1表达水平与探针摄取的相关性[25]。Ehlerding等将89Zr标记atezolizumab应用于肿瘤动物模型，对放疗引起的PD-L1表达水平变化进行显像[26]。PD-L1阳性表达的H460荷瘤鼠在每天接受5次吸收剂量为2 Gy的放射治疗后，其PD-L1表达水平明显上调，即肿瘤部位89Zr-Df-atezolizumab的摄取量明显增加。然而，此效应在PD-L1阴性表达的A549肿瘤模型中却未被观察到。Bensch等首次将89Zr标记的atezolizumab应用于患者显像，来评估患者接受抗PD-L1免疫治疗的临床响应[27]。研究表明，相比于利用免疫组织化学染色和RNA测序方法来评估PD-L1表达水平，患者对atezolizumab治疗的临床响应与治疗前89Zr-atezolizumab显像中的病灶摄取具有更好的相关性，且患者的治疗响应程度随肿瘤探针摄取SUVmax的增加而增加。相比于病情进展的患者，响应程度为部分缓解（partial response,PR）的患者SUVmax显著增加（P=0.020），响应程度为完全缓解（complete response,CR）的患者肿瘤摄取SUVmax甚至有235%的提升（P=0.00021）。此外，患者肿瘤探针摄取SUVmax与无进展生存期（progression-free survival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）具有强相关性（P=0.000028）。因此，利用89Zr-atezolizumab进行核医学分子成像可以对肿瘤PD-L1表达水平进行非侵入式的评估，以及预测患者接受PD-L1免疫治疗的响应程度。

虽然目前为止，已开发出多种核素包括111In、64Cu、89Zr标记的基于单克隆抗体的PD-L1显像方法，然而此类方法尚存一些不足之处。首先，单克隆抗体通常具有较大的分子量，其血液清除较慢且肿瘤渗透能力偏弱[28]。其次，单克隆抗体在肝脾等主要脏器的生理性摄取使得显像本底较高，通常显像需要在注射探针数天后才能进行。再次，单克隆抗体应用于显像研究通常需要使用长半衰期核素进行标记，患者受到的辐射剂量也会相应增加。因此，开发亲和力好、分子量更小、清除较快且组织穿透能力强的PD-L1显像探针将具有十分重要的意义。

3 非单克隆抗体类肿瘤免疫显像探针

近年来，科学家还利用放射性核素标记分子量相对更小的抗体片段、纳米抗体、亲合体、蛋白药物以及多肽分子等进行PD-L1显像研究。Maute等筛选出具有高亲和力的人源化PD-1胞外段（HAC段），并与人IgG-1的CH3域二聚体融合，形成了具有PD-L1靶向性的微体。他们利用64Cu标记这种微体（64Cu-DOTA-HAC），发现在PD-L1阳性表达的肿瘤注射后1 h进行显像，即可获得较高的瘤本比和瘤血比，大大缩短了注射至显像的时间间隔[29]。该探针在唾液腺、淋巴结以及脾脏等器官有较高的非特异性摄取，他们将该微体的HAC段进行糖基化修饰之后，上述器官的非特异性摄取会有降低，探针在血液中的循环时间相对延长。实验还发现，相比于64Cu，在利用68Ga标记微体进行显像时，能够获得更佳的信噪比，这也为免疫显像探针的设计提供了一定的思路。

WL12是从多肽库里筛选出来与PD-L1具有纳摩尔水平亲和力的多肽分子，Chatterjee等最先于2017年利用64Cu标记WL12多肽，并应用于PD-L1转染的CHO肿瘤显像研究[30-31]。在探针注射后 10 min即可显示肿瘤部位的高特异性摄取，在注射后1 h即可获得最佳显像效果。虽然该探针具有较高的肝脾非特异性摄取，但从注射至显像所需时间来讲，这与临床常用的PET显像探针基本相当。De Silva等[32]采用短半衰期核素68Ga标记WL12，评价了hPD-L1、MDAMB231、SUM149和CHO等四种不同PD-L1表达水平的肿瘤模型中的探针摄取，分别为（11.56±3.18）、（4.97±0.8）、（1.9±0.1）、（1.33±0.21）% ID/g。过量非标记WL12阻断可显著降低肿瘤探针摄取，证明了WL12探针与PD-L1的特异性结合。Lesniak等利用18F标记结构修饰的WL12，构建了[18F]FPy-WL12探针，并在6种不同PD-L1表达水平的肿瘤细胞中进行了探针摄取研究，与上述实验取得了相似的结果[33]，进一步证明了WL12探针的特异性，以及在PD-L1表达水平检测方面的应用价值。

Donnelly利用18F标记抗PD-L1的新型类抗体药物Adnectin（18F-BMS-986192），评价了其在PD-L1不同表达程度的肿瘤模型及健康猕猴显像中的应用价值[34]。Adnectin是一类改造自10Fn3的类抗体类蛋白药物，其结构中有2个可供修饰的loop来靶向不同靶点。18F-BMS-986192与PD-L1具有极高的亲和力（Kd=35 pM），在PD-L1高表达的L2987肿瘤中具有较高摄取，且在注射后90～120 min即可获得最佳显像效果。Niemeijer等将该探针成功转化至非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床显像研究[35]，与18F-FDG和89Zr-nivolumab相比，在PD-L1高表达的NSCLC患者中，18F-BMS-986192同样具有良好的显像效果。探针在肿瘤内的摄取与PD-L1的表达水平呈正相关，在PD-L1表达水平＞50%的肿瘤中探针摄取显著高于PD-L1表达水平＜50%的肿瘤（P=0.018），且对治疗有响应的肿瘤病灶中SUVpeak要明显高于无治疗响应的肿瘤病灶（6.5vs.3.2,P=0.03）。但在未经治疗的肺癌脑转移瘤患者中，脑部转移灶的摄取相对较低，SUVpeak仅为0.2～0.9，这可能与探针难以通过血脑屏障及PD-L1表达的异质性相关。Stutvoet等还利用18F-BMS-986192对瘤组织PD-L1表达水平和治疗诱导的PD-L1表达变化进行了无创检测[36]，结果表明18F-BMS-986192 PET显像可以在注射示踪剂60 min内检测到PD-L1的膜表达。此外，与89Zratatezolizumab相比，18F-BMS-986192显像的优势在于能够在短时间内获得更高的靶本比，允许短期内重复显像，且患者承受的辐射剂量相对更低[35]。

González Trotter等开发了一类18F标记的亲合体（Affibody）探针并应用于肿瘤PD-L1显像研究[37]。相比于单克隆抗体类PD-L1显像探针，此类分子量更小的非单克隆抗体类探针具有更佳的肿瘤渗透能力，且相对清除更快，可在注射后较短时间进行显像，同样具有一定的临床转化应用前景。

Lv等通过NOTA螯合剂将68Ga标记在分子量更小的单域抗体Nb109上，评估了68Ga-NOTA-Nb109在PD-L1检测方面的应用价值[38]。该探针制备简便，在10 min内即可获得放化产率高于95%、放化纯度大于98%的放射性药物。研究表明68Ga-NOTA-Nb109与PD-1具有不同的PD-L1结合表位，平衡解离常数仅为2.9 nM。生物分布、PET显像、放射自显影均显示探针在A375-hPD-L1肿瘤中特异性聚集，表明68Ga-NOTA-Nb109在对肿瘤组织中PD-L1无创PET显像和免疫治疗评估方面具有一定应用潜力。

基于非单克隆抗体的PD-L1探针，体内代谢清除相对较快，能够获得更低的本底摄取以提升靶本比，从而获得具有更高对比度的图像。此外，这类探针通常能够采用68Ga、18F、64Cu等半衰期更短的正电子核素进行标记，从临床应用的角度来讲更能提升患者的依从性，并降低患者受到的辐射剂量。

4 潜在的PD-L1靶向性的有机小分子探针

针对不同肿瘤细胞靶点的有机小分子抑制剂的相关研究并不少见，且有部分研究已将此类小分子抑制剂应用于肿瘤显像研究。然而截至目前，缺乏应用有机小分子抑制剂进行PD-L1显像的研究。在此，我们对有望开发成为PD-L1靶向探针的小分子抑制剂进行总结。

来自百时美施贵宝的科学家于2015年研究发现，一系列取代的联苯衍生物可作为PD-1与PD-L1相互作用的抑制剂，它们利用均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF）结合试验证实了此类抑制剂可以在纳摩尔水平（IC50:6～100 nM）有效阻断PD-1与PD-L1的结合[39-40]。该系列联苯衍生物类探针较低的IC50值使得它们有望被开发为高亲和力的PD-L1靶向性有机小分子探针。

2018年，Han等利用表面等离子共振技术（surface plasmon resonance,SPR）评价了9个基于咖啡奎宁酸（caffeoylquinic acid,CQA）的化合物与PD-1/PD-L1的亲和力与竞争抑制活性[41]。单取代CQA比双取代CQA具有更高的PD-1/PD-L1抑制活性，其中1-CQA，3-CQA，4-CQA和5-CQA能在微摩尔水平抑制PD-1/PD-L1的相互作用，其IC50分别为87.28、36.56、38.31和45.61 μmol/L。但与上述基于联苯衍生物的抑制剂相比，咖啡奎宁酸类抑制剂相对活性较低，尚需进一步改进以提升其PD-L1亲和力。

Kawashita等研究发现，结构对称性能够有效提高小分子抑制剂对于PD-1/PD-L1的抑制活性[42]。他们以BMS-1327（Kd=1.1 nmol/L）为先导化合物进行结构改进，随着化合物对称性的提升，探针对于PD-L1的亲和力也逐步提升，结构完全对称的化合物4的KD仅为0.019 nmol/L，EC50也由＞30 μmol/L逐步降低为1 μmol/L，这对于PD-L1抑制剂的研发具有重要的提示意义，而较低的KD值也使此类探针有望成为PD-L1特异性的小分子探针。此外，Basu等以BMS-202为先导化合物，研究了结构取代及对称性设计对化合物PD-L1亲和力和PPI抑制活性的影响[43]。他们发现，将BMS-202结构中的吡啶环替代为苯环，并将2-取代由甲氧基改变为4-氰基-2-吡啶甲醚结构，其IC50值将由96 nmol/L显著降低为2.5 nmol/L，且结构对称性设计可以显著降低探针的IC50值。该类探针经适合的结构改造，通过连接臂与核素螯合基团相连，或采用亲核取代的方式进行核素标记，有望形成PD-L1高亲和力的有机小分子探针。

有机小分子探针通常具有较快的体内分布和清除速率，便于利用短半衰期核素进行标记，且可在探针注射后相对较早的时间点进行显像，快速的体内分布和清除速率还能降低患者承受的辐射剂量。较低的KD值或者IC50值还能够保证探针的PD-L1特异性，降低组织器官的非特异性摄取，从而提升靶本比，有利于进行病变的观察。有机小分子通常分子量较小，在应用于显像时患者注射的药物通常在微克甚至更低水平，难以产生明显的药理或毒理作用，从而保证了显像的安全性。靶向PD-L1的有机小分子抑制剂研究，为PD-L1显像探针的开发提供了另外一种思路和可供选择的对象。对于小分子化合物探针进行核素标记时，有多种可供选择的放射性核素，比如进行18F标记时，可以化合物中的氨基或者羟基进行延伸，链接乙二醇结构，再进行酯化形成三氟甲磺酰酯结构作为离去基团进行亲核取代。还可通过连接臂将DOTA（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N,N'-tetraacetic acid，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸）或者NOTA（1,4,7-triazacyclononane-N,N',N''-triacetic acid，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸）螯合剂与小分子抑制剂结合起来，从而进行68Ga、64Cu、Al-18F等的标记。

5 总结与展望

PD-L1表达水平的检测对于肿瘤免疫治疗具有重要的指导作用，但有创式的穿刺活检取病理组织进行免疫组织化学检测的方法存在诸多局限性，受到PD-L1表达异质性、抗体多样性以及组织制备和染色方法差异性的影响。核医学分子影像能够实现患者原发灶和转移灶中PD-L1表达水平的在体、无创评估，包括核素标记的单克隆抗体、纳米抗体、多肽分子等多种探针已被应用于临床前和临床转化研究。此外，靶向PD-L1的有机小分子抑制剂的研究为开发高亲和力的PD-L1显像探针提供了新的思路，并且在使用治疗性核素177Lu或者90Y标记之后，此类小分子抑制剂还有望在肿瘤的靶向治疗中产生一定的应用价值。