全反式维甲酸与肝脏疾病的关系及其分子机制研究进展

许召君，陈小彬，才保加，王成，乔文杰，刘光照，王鑫乐，刘韬，马晓明

（1.青海大学研究生院，青海西宁810001；2.青海大学附属医院胃肠外科，青海西宁810001）

1995年，美国食品和药物管理局（FDA）批准了全反式维甲酸（ATRA）药物在急性早幼粒细胞白血病（APL）中的应用。迄今为止，通过口服ATRA 治疗APL 仍作为标准疗法[1]。自20世纪70年代分化治疗概念提出后[2-3]，被逐步运用于癌症治疗，其中包括ATRA 在内的分化治疗药物，也被越来越多地运用于肿瘤疾病的治疗[4]。此外，ATRA在多个系统中显示出抗血管生成的作用，抑制了血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖并显现出对类风湿关节炎的抗炎作用。不仅如此，肝脏疾病（主要包括非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝细胞癌）作为全球流行性疾病，严重威胁着人类的生命健康。近年来，ATRA 亦被广泛应用于肝病的防治，国内外研究员就ATRA 的保肝机制和临床应用进行了大量的研究发现，ATRA 参与调控肝脏疾病的发展进程，如调控细胞的增殖、侵袭以及凋亡等。本文归纳了ATRA 与肝脏疾病相关的研究文献，从多个角度阐述了ATRA 与肝脏疾病（非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝细胞癌）的关系及其涉及的相关分子机制，为临床试验ATRA 治疗肝脏疾病提供指导依据。

1 ATRA的代谢

ATRA 做为维生素A 的主要生物活性形式，可调节细胞的增殖与分化。由胃肠道吸收的视黄醇通过两步反应氧化为ATRA，第一步，视黄醇主要通过乙醇脱氢酶（ADH）或视黄醇脱氢酶（RDH）与视黄醛发生可逆氧化，RDH 能够将视黄醛转化回视黄醇，醛酮还原酶（AKR）也可以进行相同的反应；第二步，视黄醛被视黄醛脱氢酶（RALDHs 或ALDHs）不可逆地氧化为ATRA。ATRA 通过单纯弥散进入细胞，与细胞内维甲酸结合 蛋 白（cellular retinoic acid binding protein，CRABP）结合后有两种去路：一是由位于内质网上的细胞色素P450 氧化还原酶（细胞色素CYP 酶）降解[5]，另一种通过异构酶的作用，转化为其立体异构体，如13-顺式维甲酸（13-cisRA）和9-顺式维甲酸（9-cisRA）[6]。ATRA 或其异构体进入细胞核内，与核维甲酸受体（RAR）或维甲类X 受体（RXR）结合形成异二聚体RAR/RXR 或同二聚体RXR-RXR，后者进一步结合特定DNA 序列-维甲酸反应元件（RAREs），从而影响目的基因的转录，产生类维甲酸反应。ATRA 通过与维甲酸受体（RARs）结合，后者可与视黄醇类受体（RXRs）形成二聚体，该二聚体与目的基因的调控序列结合并通过招募辅助激活因子启动目的基因的转录[7-8]；在缺乏配体的情况下，RAR/RXR 异二聚体与维甲酸靶基因的维甲酸反应元件（RAREs）结合并招募辅助抑制子如NCoR 和SMRT 抑制目的基因的转录[9-10]。由ATRA 或其异构体激活的RAR 和RXR 途径是经典途径，在调控细胞的生长、分化、凋亡等方面发挥重要作用。

2 ATRA 对非酒精性脂肪性肝病调控机制研究

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎，指由单纯脂肪变性向进展性脂肪变性的转变，进而演变为肝炎、肝硬化、肝细胞癌[11]。NAFLD 是导致慢性肝病的主要原因，已成为社会公共健康问题，其发病率逐年升高，据统计其全球发病率高达25.2%，与地区和社会条件有关[12]。NAFLD 具体的发病机制尚不明确，有学者[13-14]认为一些因素如内质网应激、氧化应激、脂代谢紊乱、脂肪因子和细胞因子的生成、线粒体功能失调等共同参与NAFLD 的发生发展，而线粒体功能失调是核心因素。

目前许多文献已报道多种脂肪因子如adiponectin、leptin、resistin 与NAFLD 发病密切相关，chemerin 又名TIG2（tazarotene-induced gene 2）作为一种新的脂肪因子于2007 首次报道，编码该蛋白的基因被发现受维甲酸类药物他扎罗汀调控。张强[15]发现在NAFLD 中，脂肪因子chemerin 在mRNA 水平表达下降，其受体CMKLR1 在mRNA 水平表达上调，RARb 在NAFLD 中的表达下降，推测chemerin、CMKLR1、RARb 可能参与了NAFLD 的发病。同一作者通过实验进一步证实了ATRA 可以上调HepG2 细胞chemerin 在mRNA 及蛋白水平的表达。Nagpal 等[16]认为chemerin 只可被RARb、RARr的激动剂诱导表达，而非RXR 或VDR 的激动剂诱导表达。Kato 等[17]报道维甲酸可使大鼠肝脏RARb的表达上调，因此NAFLD 中肝脏脂肪酸的增加导致视黄醇的酯化增加而活性形式降低且肝脏存在炎症反应及HSCs 的激活导致维甲酸含量的降低，导致RARb 的表达下调进而导致chemerin 表达的下降。

3 ATRA对肝纤维化调控机制研究

3.1 ATRA 通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路抗肝纤维化

肝纤维化是肝脏中可逆的伤口愈合反应，是对慢性肝损伤（酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、乙型肝炎病毒、和丙型肝炎病毒）的反应，如果不受控制，进行性肝纤维化可导致肝硬化，肝细胞癌（HCC）和终末期肝病。肝纤维化是由细胞外基质（ECM）产生和降解的长期不平衡导致的[18]。肝纤维化发展过程中ECM 成分的主要来源是肝星状细胞（HSC），它位于肝细胞和肝血窦内皮细胞之间的区域，称为“Disse 间隙”，约占正常肝细胞的8%～14%[6,19]。肝损伤后，HSC 由储存维生素A 的静止细胞转变为高度增殖的成肌纤维细胞，从而上调α-1 I 型胶原蛋白（COL1α1）的合成和α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，从而促进伤口闭合[18]。

HSC 激活是肝纤维化的关键，受多种细胞因子和生长因子的控制。其中一个重要机制是涉及Wnt 信号通路的活化，Myung 等[20]在体外用Wnt3a处理人的HSC 细胞，结果提示COL1α1 和α-SMA 表达显著增加，而用Wnt3a 相关抑制剂分泌型相关蛋白（sFRP）处理HSC 细胞，结果提示COL1α1 和α-SMA 显着降低，表明Wnt 信号通路通过激活HSC参与了肝纤维化的形成。其中涉及的机制：通过激活Wnt/β-catenin 信号通路使胞质中的β-catenin 稳定性和表达水平显著提升并促使β-catenin 向细胞核内转移，从而激活相关靶基因的转录，其中与包括与肝纤维化密切相关的靶基因（COL1α1、α-SMA、cyclin D1、uPAR 以及基质金属蛋白酶家族如MMP-1，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-13 等）。ATRA 可通过诱导RORα 磷酸化，抑制Wnt/βcatenin 的信号传递，进而发挥抗纤维化的作用[21]。

3.2 ATRA通过TGF-β-Smad信号通路抗肝纤维化

转化生长因子β（TGF-β）对从最初的肝损伤到炎症和纤维化以及慢性肝病进展的所有阶段都有贡献[22]。肝损伤诱导受损的肝细胞和炎性细胞释放活性TGF-β，从而上调了涉及纤维生成的几种生长因子和细胞因子的合成和释放，包括血小板衍生生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CCN2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和各种白介素（ILs）（IL-1β 和IL-6）[23]。此外，TGF-β 的上调促进了肝细胞破坏（死亡）并介导了HSC 的活化，从而导致伤口愈合反应，这暗示着成肌纤维细胞的生成和ECM 的沉积[24]。CCN2 与肝损伤的发展有关，其过表达可导致纤维化加重，TNF-α 参与胆汁淤积性肝纤维化，IL-1β 刺激ECM 的合成，而IL-6诱导胶原蛋白的合成并加剧肝炎[25-28]。越来越多的研究表明，HSC 的激活是由复杂的调控机制来协调的。相关研究也提示ATRA 可通过转化生长因子TGF-β-Smad 信号通路抑制系膜细胞环氧化酶-2 的表达，显示其具有良好的抗纤维化作用[29]。陈珂等[30]通过ATRA 对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）体外干预实验探讨相关机制，结果提示ATRA 能够通过抑制HSC-T6 细胞中TGF-β1 的下游信号蛋白Smad2/3 的表达来影响TGF-β1/Smad 信号通路，从而发挥其抗肝纤维化作用。

4 ATRA对肝癌调控机制研究

肝癌在2018年的死亡人数超过781 000，被列为全球第三大致命性实体癌。在肝癌中，肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肝肿瘤（90%）[31]，HCC 的症状大多发生在晚期，这时HCC 极易侵入门静脉而引起门静脉肿瘤血栓。其他较不常见的亚型包括胆管癌，肝母细胞瘤以及纤维板层型癌。尽管近年来在诊断和治疗方式上取得了长足的进步，但5年生存率仍为5%～10%[32-33]。2007年，靶向小分子药物索拉非尼被批准用于治疗晚期肝癌并且在随后的10年中，索拉非尼一直是晚期HCC的唯一一线治疗靶向药物。但是，许多临床研究表明，相当一部分肝癌患者对索拉非尼不敏感。实际上从索拉非尼治疗中显著受益的患者人数非常有限，索拉非尼的总体疗效远不能令人满意，这引起了研究人员的注意。近年来，一些研究将ARTA 用于肝癌的治疗也取得了一定的成果，徐益语等[34]在国内首次应用维甲酸对66 例原发性肝癌患者进行治疗，结果提示有效率达15.2%、病情稳定率达74.1%、41.8%的患者甲胎蛋白下降。而且相关研究也利用维甲酸提高癌细胞对化疗药物的敏感性的特点，与其他抗癌药物联合使用，极大地提高了治疗效果，大大降低了药物带来的不良反应，为肝癌的治疗开辟了新的途径。

4.1 ATRA相关代谢酶与肝癌细胞的关系

Kropotova 等[35]发现ATRA 生物合成的每个步骤都存在失调，编码视黄醇氧化/还原成视黄醛相关酶mRNA 的水平显著降低（ADH1B，ADH1C，RDHL，AKR1B10 存在于两种类型的癌症中，RDH5 仅存在于大肠癌中，而ADH4，AKR1B 和RDH12 仅存在于胃癌中）。相关研究报道表明，HCC 细胞中AKR1B10 处于高表达，主要涉及的机制为AKR 过表达的酶通过视黄醛转化为视黄醇引起ATRA 细胞内剥夺，这种情况通过阻止细胞分化并促进细胞增殖来诱导癌变[36]。为了支持这一假设，一些学者进行肝癌的相关实验也发现了AKR酶的上调，因此，一些专家建议将它们作为诊断，分期和预后的早期检测标记[37]。部分研究提示，细胞色素CYP26A1 与肿瘤密切相关，其过表达在一定程度上可协助肿瘤细胞的转移，CYP26A1 在结肠直肠癌、42%的原发性乳腺癌中均处于高表达水平，且在HCC 细胞中也发现了CYP26A1 与CYP26B1 一起处于上调水平[38]。

4.2 ATRA对肝癌细胞凋亡调控相关分子机制

细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的一种程序性细胞死亡，肿瘤细胞消除的主要途径，已知ATRA 通过不同的机制可以抑制细胞的增殖、诱导分化从而导致死亡。尽管对ATRA 的研究已开展许久，但ATRA 促凋亡作用的机制仍不完全清楚。其中公认的途径包括内源性和外源性凋亡途径。ATRA 可通过上调TNF-α、caspase-8 和死亡受体Fas激活外源性凋亡途径[39-41]，ATRA 可以下调一些抗凋亡分子的表达，如Bcl-2，cdk2，cyclin D1[42]。主要机制是ATRA 通过抑制Bcl-2 和Bcl-x 蛋白表达并激活caspase-6、7、8、9，进一步导致细胞色素C从线粒体中释放到胞浆中，同时细胞色素C 在dATP 作用下激活caspase，引起级联反应，从而诱导细胞凋亡[43-44]。周青等[45]通过用1 μmol/L 和10 μmol/L 浓度的ATRA 处理HepG2 细胞，发现ATRA 处理的HepG2 可导致其细胞生长数目减少、细胞增殖降低、迁移能力减弱、凋亡小体增多等，提示ATRA 作为诱导分化剂，可抑制HepG2 细胞增殖并诱导其发生细胞凋亡。

4.3 通过介导胰岛素样生长因子（IGF）促生存作用来调控细胞的增殖

胰岛素样生长因子（IGF）是一组具有促生长作用的多肽类物质，IGF 族有IGF-I 和IGF-II 两种，IGF I 和II 以及胰岛素可刺激多种癌细胞系的增殖。其中涉及的机制涉及IGF-I/-II 与I 型IGF 受体（IGFIR）结合，主要激活衔接胰岛素受体底物-1（IRS-1），IRS-1 与p85 的相互作用诱导PI3-激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT 的激活，从而引发抗凋亡途径，而0.1-100 µM 剂量的ATRA 抑制了该途径[46]。相关研究发现MCF-7 细胞系中IGF 结合蛋白3（IGFBP-3）的表达不足，提示IGFBP-3 是生长的负调节剂，而ATRA 可通过诱导RAR β 的表达直接参与IGFBP-3 的表达，表明ATRA 对IGF 信号转导抑制作用[47]。同样，研究[47]发现RARα 参与肝癌细胞中IGFBP-3 的上调。Dokmanovic 等[48]在后来的研究中也证实了ATRA 治疗后，IGFBP-3 处于高表达的状态。

4.4 通过介导维甲酸诱导基因1（RIG1）甲基化来调节细胞的增殖

RIG1 被称为视黄酸受体3（RARRES3）或他扎罗汀诱导基因1（TIG1）。正常组织与中度和低分化肿瘤相比，正常组织中RIG1 的水平更高[49]。在人类HCC 组织中发现RIG-1 被下调，同时发现RIG-1 缺乏会促进HCC 癌变，涉及机制为RIG-1 通过下MMP-9 抑制HCC 的增殖、迁移和侵袭的能力，RIG1 表达的降低与RIG1 启动子甲基化密切相关，在53%的原发性恶性肿瘤中甲基化密度>30%，与邻近的非癌组织相比，HCC 组织中也发现了异常的甲基化，并且与肝脏和胆道的致癌事件有关[50]。一篇2017年的论文将RIG1 的表观遗传沉默与肝癌中上调的G9a 组蛋白甲基转移酶的过表达相关[51]。随后的研究确定了RIG1 启动子中的视黄酸反应元件[52]。也证实了ATRA 可以诱导RIG1 表达增加，调节细胞的增殖。

5 总结与展望

肝脏在维生素A 的吸收、贮存以及代谢过程中扮演着重要的角色，其中肝细胞主要参与维生素A 的代谢，HSCs 将维生素A 以脂蛋白的形式进行贮存[53]。综上所述，NAFLD 中维甲酸的含量明显降低，chemerin、CMKLR1、RARb 可能参与了NAFLD 的发病，而ATRA 可以上调chemerin 的表达，笔者认为可以通过补充维甲酸来延缓NAFLD疾病的进展，还需大量研究进一步证实；目前也有不少动物实验表明其具有抗肝纤维化的作用，补充维生素A 可有效减轻肝纤维化；ATRA 在临床上多用于白血病的治疗，近年来也将其应用于肝癌的治疗，本文从多个途径阐述了ATRA 抑制肝癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡，尽管在临床前阶段发现了新疗法，但在临床试验中缺乏疗效，只有弄清ATRA 对肝癌治疗的相关机制，才有可能设计出协同克服关键步骤的联合疗法。在过去的几年中，进行了一些组合试验，但结果并非预期的，表明仍需详细了解其分子机制，同时还需在临床前阶段中围绕肝癌细胞系研究ATRA 的毒性，ATRA 为肝病治疗提供了一个新的策略，值得进一步深入研究。