成骨过程中细胞内能量代谢研究进展

叶嘉鹏 王建伟 马勇 张亚峰 张强 张宗瑞 尹恒,* 肖吉日木图,3 李绍烁

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210038 2. 南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071 3. 内蒙古医科大学，内蒙古自治区 呼和浩特 010110

骨质疏松症是一个危害老年人生活质量的公共健康问题，骨的形成依赖于骨组织中产生足够数量的成骨细胞以及单个成骨细胞的活性[1]。成骨细胞能量代谢会影响其分化和功能。这些细胞用来产生ATP的物质来源和途径正在被广泛研究，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸在细胞内的代谢变化。细胞的变化如分化和增殖，可以引起新陈代谢的变化，也可以依赖于新陈代谢，不同的细胞根据细胞自身的功能和环境表现出不同的能量供应需求。在骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为成骨祖细胞，再到极化、高度成熟的成骨细胞过程中，细胞内代谢会不断的改变，与细胞功能相适应。

1 成骨细胞内的葡萄糖代谢

1.1 葡萄糖代谢途径

葡萄糖代谢中糖酵解途径、磷酸戊糖途径、己糖胺生物合成途径是较为常见的代谢途径[2]，葡萄糖通过其转运蛋白(GLUT)转运到细胞内，通过糖酵解产生两分子丙酮酸、两分子ATP以及两分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。丙酮酸可以被乳酸脱氢酶(LDH)转化为乳酸，这个反应可以再生糖酵解所需的NAD+。丙酮酸还可以进入线粒体通过丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)脱羧形成乙酰CoA后进入三羧酸(TCA)循环。TCA循环不仅通过氧化磷酸(OxPhos)化产生ATP，而且还提供中间分子参与细胞的生物合成。糖酵解中间产物还可以进入细胞内的其他代谢途径，葡萄糖-6-磷酸(G6P)可以转化为糖原储存或通过磷酸戊糖途径(PPP)代谢。PPP不仅产生合成核酸的5-磷酸核糖，而且还可以产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。来源于G6P的果糖6磷酸(F6P)可以进入己糖胺生物合成途径(HBP)，产生尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)用于蛋白质糖基化。

1.2 成骨过程中细胞内葡萄糖摄取

成骨细胞已经被证明[3]表达几个GLUT家族转运蛋白，例如 GLUT1、GLUT3和GLUT4 ，它们参与葡萄糖代谢和调控成骨细胞功能。GLUT1在成骨细胞谱系中表达水平最高，与Runx 2参与一种前馈机制，葡萄糖通过抑制AMPK依赖性的Runx 2蛋白酶体降解来促进成骨分化，并通过抑制AMPK来促进骨形成，其次还能通过诱导mTORC1介导的蛋白合成促进胶原基质的生成[4]。Mst1/2激酶在骨骼发育和重塑过程中是葡萄糖摄取所必需的，Mst1/2激酶稳定了成骨细胞中主要的葡萄糖转运蛋白GLUT1，从而调节AMPK的活性，抑制GLUT1的表达会激活AMPK，并通过泛素化导致Runx 2的降解，从而减弱骨形成[5]。葡萄糖进入骨组织还少部分受到胰岛素的调节，喂食高脂饮食和具有成骨细胞特异性胰岛素受体缺失的小鼠模型显示，骨组织对葡萄糖摄取下降[6]。GLUT4 (由Slc2a4编码)是原代成骨细胞分化过程中唯一表达增加的葡萄糖转运体，它需要胰岛素的刺激来吸收葡萄糖，slc2a4缺失的原代成骨细胞显示出由骨钙素表达下降和胞外钙流入减少，然而Slc2a4缺失的小鼠并没有明显的骨丢失，却出现高胰岛素血症和胰岛素抵抗[7]。

1.3 成骨过程中细胞内葡萄糖的分解代谢

分化的成骨细胞的糖酵解和OxPhos水平都高于未分化的细胞，但OCR(耗氧率)/ECAR(细胞外酸化率)比率逐渐下降，分化后的细胞倾向糖酵解，即使在氧气存在的情况下，也以糖酵解为主，这种现象类似于癌细胞中的Warburg效应[8]。Guntur等[9]的研究同样发现分化的MC3T3-E1成骨细胞主要通过糖酵解来满足ATP的需求，而未分化的细胞则通过OxPhos化来产生ATP，但当它们分化为脂肪细胞时，细胞内依然以OxPhos为主，这项研究说明了不同的代谢谱和细胞分化的方向相关。人脂肪来源间充质基质细胞(adMSC)在非分化和成骨诱导条件下，糖酵解标志酶磷酸果糖激酶(PFK)和戊糖磷酸途径标志酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)的含量增加，但在诱导脂肪细胞形成时，伴随细胞增殖的减弱，糖酵解能力降低，并诱导线粒体酶活性增加，OxPhos加强，说明adMSC在成骨和成脂分化过程中能量代谢与特定细胞分化方向相适应[11]。但为什么细胞依赖于糖酵解这种低效生成ATP的模式，Yang等[12]认为氧糖酵解的必要性是需要以更快的速度产生ATP，提供代谢中间体来支持基质蛋白的合成，增加进入TCA循环的丙酮酸用于产生柠檬酸，这在结构上对骨骼中磷灰石纳米晶的形成具有重要意义。而Karner等[13]认为这种代谢方式有助于成骨细胞分化的表观遗传调控。然而在人类间充质干细胞(hMSC)在成骨分化过程中，线粒体OxPhos的增加，其糖酵解水平和未分化的细胞相比无明显改变[10]。Chen等[14]同样发现未分化的hMSCs表现出较高水平的糖酵解酶和乳酸产率，在hMSCs成骨分化过程中，能量生产从糖酵解过渡到OxPhos。因此不同来源的细胞在成骨分化中有着不同的代谢方式。然而Pattappa等[15]和Esen等[16]使用了含有丙酮酸的培养基，丙酮酸可以直接进入线粒体TCA循环,人为地增加未分化细胞的耗氧量，因此在成骨过程中没有发现OxPhos的变化。

2 成骨细胞内的脂肪酸代谢

2.1 脂肪酸的代谢途径

长链脂肪酸的运输是由位于线粒体外膜和内膜的双肉碱脂酰转移酶(CPT)介导的。脂肪酸通过脂酰CoA合成酶活化成脂酰CoA，穿过外膜，在肉碱的协助下，通过位于线粒体外膜的CPT1、内膜的肉碱脂酰肉碱转位酶和CPT2进入线粒体基质。脂肪酸通过活化成脂酰CoA在线粒体内进行β氧化(脱氢、加水、再脱氢、硫解)产生ATP。一个饱和脂肪酸氧化分解成乙酰CoA、NADH和FADH2，乙酰CoA进入TCA循环，而NADH和FADH在电子传递链中生成ATP。单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸必须异构化和还原，然后才能被β氧化。

2.2 脂肪酸的摄取

富含成骨细胞/骨细胞的股骨干对乳糜微粒的摄取大于骨髓，表明正常的成骨细胞增殖需要血清脂蛋白[17]。成骨细胞表达低密度脂蛋白受体(LDLR)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，LDLR的的消融导致与成骨细胞分化相关的基因表达减少[18]。成骨细胞还表达高密度脂蛋白(HDL)的主要受体Scarb1[19]，BMSC中缺失Scarb1增加了成骨细胞形成，但降低了终末骨细胞分化[20]。但Tourkova等[21]报道缺乏Scarb1的小鼠在16周时骨吸收和骨形成的标志物减少。此外骨吸收的脂肪酸很可能被代谢成ATP，因为体内骨新合成脂肪的量很低[22-23]。成骨细胞还表达CD36直接摄取游离脂肪酸，CD36缺失小鼠骨形成率降低和成骨细胞分化障碍，但CD36在成骨细胞对脂质摄取的具体作用仍有待进一步证明[24]。SLC27脂肪酸转运蛋白家族，也被成骨细胞用来获得脂肪酸以供氧化[25]。

2.3 成骨过程中细胞内脂肪酸的分解代谢

脂肪酸可以通过以下方式获得：葡萄糖底物的从头合成；膳食来源的乳糜微粒；脂肪细胞；细胞内脂滴的脂解。成骨细胞表达高水平的GlUT1和CPT1a，表现出较高的耗氧水平以及代谢棕榈酸酯的能力增强，表明其依赖脂肪酸氧化作用，下调CPT1a的表达会阻碍成骨细胞分化，而在骨折修复过程中局部注射游离脂肪酸会增加愈伤组织中形成的骨数量，减少软骨数量，因为低水平的脂肪酸激活FOXO3促进软骨形成[26]。研究发现成骨细胞中存在脂滴，未分化的BMSC含有很少的脂滴，而成骨诱导下第2天脂滴增加，7 d后更加明显，并且检测成骨基因的表达，用 CPT1抑制剂etomoxir (ETO)阻断线粒体脂肪酸摄取，发现BMSC成骨分化第0天和第2天的OCR显著降低，而在第7天成熟的BMSC的OCR略有下降，而ECAR没有明显改变，表明在BMSC成骨分化的早期脂滴的快速分解和利用产生ATP，成熟的成骨细胞似乎没有以类似的程度利用脂肪酸，导致它们随后的积累[27-28]。虽然在成骨细胞中脂滴分解的机制尚不清楚，但在其他组织中已被描述为通过两种不同的机制发生：①脂滴相关的细胞质脂肪酶;②自噬小体隔离脂类并随后被溶酶体酸性脂肪酶降解，称为脂噬[29]，这两个过程都导致游离脂肪酸的释放。PAT家族中脂滴相关蛋白(PLIN1-5)的基因在BMSC中表达，值得注意的是PLIN2在第2天表达量最高，在第7天却检测到PLIN2的裂解物[28]。脂滴表面的PLIN2通过伴侣蛋白介导的自噬(CMA)被降解，从而启动脂解[30]，此外PLIN2已被证明是蛋白酶体降解的靶标[31]，这可能是检测到PLIN2裂解物的另一个原因。Kim等[22]发现这些储存的脂质似乎不是成熟成骨细胞功能的主要能量来源，在体外培养的颅骨成骨细胞、成熟成骨细胞和体内成骨细胞中，ATGL的表达均被阻断，它能消除细胞内脂解作用，但在体外成骨细胞性能和体内骨结构中均未发现缺陷。因此，成骨细胞似乎需要胞外的脂质。然而未分化的BMSC中糖酵解对ATP产量的贡献率大于97 %，而葡萄糖和脂肪酸的氧化仅贡献了ATP产量的3 %[32]，而且棕榈酸酯还诱导BMSC凋亡和抑制增殖，但这种作用被不饱和脂肪酸油酸阻止。此外脂肪酸氧化也能减轻棕榈酸酯对成骨细胞的负面影响[33]。

3 成骨细胞内的氨基酸代谢

3.1 氨基酸的代谢途径

氨基酸分为必需和非必需氨基酸,或者分为生酮和生糖氨基酸，是成骨细胞合成蛋白质或代谢产生ATP的基础原料。其中生酮氨基酸代谢为乙酰CoA或乙酰乙酸盐，而生糖氨基酸则转化为丙酮酸或TCA循环的中间体，包括草酰乙酸、戊二酸、富马酸和琥珀酰CoA。因此，氨基酸可以通过TCA循环和OxPhos直接促进ATP的产生。事实上，TCA循环中的氨基酸分解代谢在多能祖细胞维持和分化是必需的[34-35]。

3.2 氨基酸的摄取

对成骨细胞氨基酸摄取的初步研究定义了骨骼中的多种转运系统，包括系统A、L和ASC，并提出了成人和胎儿骨骼之间氨基酸转运的差异，还发现cAMP、甲状腺素、胰岛素和IGF1在成骨细胞中调节氨基酸的转运[36]。研究[37]表明，单个氨基酸转运体与骨生物学有关，例如胱氨酸/谷氨酸逆向转运体XCT可能通过减少谷胱甘肽的产生来抑制成骨细胞的分化。ATF4转录调控一系列编码氨基酸转运体和氨基酸合成酶的基因，以增加氨基酸获取，GCN2通过增加ATF4下游的氨基酸摄取来调节小鼠骨祖细胞(SSPC)的增殖，有利于维持骨稳态[38]。

3.3 成骨过程中氨基酸的分解代谢

谷氨酰胺是血液中最丰富的氨基酸，谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶(GLS)转化为谷氨酸，然后转化为α-酮戊二酸(α-KG)，进入TCA循环，而且大部分TCA循环的碳和一些非必需氨基酸中的氮来自细胞中降解的谷氨酰胺[39-40]。骨髓基质细胞消耗的谷氨酰胺减少与衰老相关的成骨细胞分化受损有关[41]，成骨细胞内的GLS和谷氨酰胺代谢可以促进骨骼干细胞(SSCs)的增殖和向成骨细胞的分化，促进基质矿化以增加骨量[42]。有研究[43]表明，miRNA-206通过结合GLSmRNA，抑制GLS的表达和谷氨酰胺代谢，最终抑制BMSC的成骨分化。BMSC在成骨分化时代谢大量的谷氨酰胺，进入TCA循环中提供ATP，而对柠檬酸的贡献下降，谷氨酰胺还可以通过增加谷胱甘肽含量抵消ROS对成骨分化的不利影响。另外，与对抗ROS的积极作用相比，谷氨酰胺对BMSC成脂分化的影响较小，线粒体产生的ROS以mTORC1依赖的方式促进脂肪细胞的分化，这可以解释脂肪细胞分化过程中谷氨酰胺消耗和GLS活性相对于未分化的BMSCs没有改变的现象[44-45]。而骨祖细胞的增殖似乎与谷氨酰胺相关性不大，这表明不同类型的细胞中谷氨酰胺代谢的不同作用[46]。同样在ST2细胞内谷氨酰胺分解代谢的增加促进了细胞蛋白质的生物合成[47]。与预分化细胞相比，分化的脂肪细胞(3T3L1)特异性地利用了支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸[48]，这些氨基酸在成骨细胞分化中所起的作用目前尚不清楚。谷氨酰胺对骨骼中能量的产生和氧化还原平衡都起着关键作用，这可能是治疗骨质疏松症的新策略。已有研究[41,49]报道衰老相关的谷氨酰胺代谢的改变可通过破坏谷氨酰胺代谢关键酶或线粒体代谢恶化来打破BMSC成骨分化和成脂分化之间的平衡。谷氨酰胺的前体2-氧化戊二酸(2-Ox)在胃底切除导致的骨量减少的骨骼中增加松质骨、生长板和关节软骨的厚度[50]。它还应用于糖皮质激素引起的骨质疏松症，提高了生长激素和骨钙素的浓度，并维持骨小梁的微结构[51]。此外蛋白质和氨基酸摄入可以促进成骨细胞分化和增加骨密度，但过多摄入酸化氨基酸 ( 如半胱氨酸和甲硫氨酸) 会增加患骨质疏松症的风险[52-53]。

4 讨论

尽管转录因子和信号通路已经被广泛研究，但对成骨过程中细胞代谢的状态了解较少，由于体外实验无法完全模拟体内骨髓环境，未来的研究需要进一步明确成骨细胞在骨髓环境中不同分化阶段的代谢表型。而代谢变化对成骨细胞分化和功能影响的分子基础有待研究阐明。骨形成过程中葡萄糖、脂质、氨基酸在细胞成骨过程中的动态能量分配需要进一步研究。此外，了解破骨细胞、骨细胞和脂肪细胞等其他骨组织内细胞的生物能量学对于全面了解骨的代谢调节是很必要的。这些研究成果将来可以应用于慢性代谢性骨病的治疗，还能应用于针对新靶点药物的研发。