脑缺血/再灌注损伤后线粒体结构与功能稳态失衡机制的研究进展

吴 丹 漆仲文 张 伟 马 妍

1.天津中医药大学研究生院，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院脑病科，天津 300151

脑卒中具有高致死率、高致残率、低治愈率的特点，预计到2030 年，脑卒中患病人数将继续上升到7700 万，造成更多的经济和社会负担[1-2]。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率占脑卒中总数的70%～80%[3]，远高于出血性脑卒中。静脉溶栓是目前治疗急性缺血性脑卒中的重要内科治疗手段[4]，但因治疗时间窗及应用风险等原因，其在临床应用受到限制。诸多研究表明，线粒体结构完整性及其功能稳态平衡的破坏是缺血性脑卒中主要病理环节之一[5]。缺血性脑卒中首先表现为脑缺血损伤[6]，再灌注对于保护受损脑组织是必不可少的，但恢复血流后脑缺血/再灌注损伤也是不可避免的[7]。脑缺血/再灌注损伤主要包括钙超载、氧化应激及线粒体功能紊乱等环节[8]。线粒体是一种半自主细胞器，不仅在能量代谢中发挥重要作用，而且在控制细胞存亡的过程中也扮演着重要角色，脑缺血/再灌注损伤后细胞凋亡的发生主要取决于线粒体[5]。近年来，有关脑缺血/再灌注损伤后线粒体结构及功能变化研究取得了一定进展，对促进缺血性脑损伤神经元保护具有较大意义。本文对脑缺血/再灌注损伤后线粒体结构与功能稳态失衡的研究进展进行论述，旨在为临床及实验研究提供参考。

1 线粒体与脑缺血/再灌注损伤

线粒体是细胞钙稳态调节的主要结构，细胞钙超载可导致氧化应激，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮，其中以线粒体内ROS 大量生成为主[9-10]。线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是ROS 依赖的位于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，线粒体内钙超载及氧化应激可通过脂质过氧化、损伤线粒体呼吸链等导致mPTP 的大量开放，进而使线粒体膜电位下降，释放细胞色素C 等[11]。细胞色素C 为位于线粒体内膜的小分子蛋白，它作为线粒体呼吸链复合物Ⅲ和复合物Ⅳ之间的电子载体，其释放可活化Caspase-9，继而活化凋亡执行蛋白Caspase-3，最终导致神经元凋亡[8]。可见线粒体结构完整性及其功能稳态平衡的破坏是脑缺血/再灌注损伤的关键环节，保护线粒体结构和功能是脑缺血/再灌注损伤后神经元保护的重点。

2 脑缺血/再灌注损伤后线粒体稳态失衡的机制

2.1 氧化应激

氧化应激是脑缺血主要有害因素之一。正常生理条件下适量ROS 在一些重要生理过程中起关键作用，它可以被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶和如谷胱甘肽等抗氧化剂迅速清除[12]。脑缺血时引起的线粒体呼吸链功能障碍在细胞中产生氧化应激，对线粒体功能稳态及防御造成巨大影响，使其无法正常清除氧自由基而导致细胞死亡。脑缺血后线粒体中氧气减少，限制氧化磷酸化，ATP 生成减少，导致电子传输链释放氧自由基，并在线粒体中产生大量ROS；而在再灌注过程中，供氧恢复后，促氧化剂酶系统和线粒体利用氧气作为底物产生大量氧自由基，在细胞中产生大量ROS 并最终触发从细胞信号通路改变到细胞死亡一系列过程[13]。所以线粒体是细胞内ROS 的主要贡献者，通过氧化磷酸化和其他酶反应将分子氧转化为SOD 和过氧化氢。电子传输链是超氧化物的主要来源，线粒体在氧化磷酸化过程中通过细胞色素C 氧化酶将氧气还原成水。

此外，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）也被认为是脑缺血后ROS 形成的来源之一。NOX 作为一种促氧化酶，缺血会诱导其激活，加剧脑组织氧化应激；而ROS 对缺氧条件敏感，脑血流再灌注后缺氧诱导因子会诱导NOX 产生更大量的ROS[14]。再灌注期间SOD 等内源性抗氧化酶表达降低，无法进行有效氧化清除工作，不能有效阻止氧化剂介导的脑损伤，导致缺血后的线粒体功能障碍及随后的细胞凋亡[15]。

2.2 线粒体通透性转换孔

mPTP 是控制线粒体基质和细胞质间分子交换的调节孔，由三种蛋白质组成：线粒体外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）中的电压依赖性阴离子通道、线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）中的腺嘌呤核苷酸转位酶及线粒体基质中的亲环素D（cyclophilin D，CypD）[16]，其中CypD 对mPTP 的调节最为关键，是参与神经元缺血性死亡的重要部分。正常情况下mPTP 处于关闭状态，IMM 选择性地使小分子代谢底物与离子通过，当细胞发生氧化应激，基质内Ca2+浓度升高，IMM 特异性孔位开放，mPTP 通透性增加，使大量小分子物质及带电离子如ROS 等进入胞内，造成线粒体损伤，同时将细胞色素C、丝氨酸蛋白酶等从线粒体释放到胞浆中，细胞色素C 与胞浆中促凋亡激活因子Apaf1 结合，触发Caspase 级联效应，激活Caspase-3，导致神经元细胞死亡[17]。临床上多使用CypD 抑制剂环孢菌素进行干预，但因其毒性和免疫抑制作用在应用时受到限制[18]。

2.3 钙超载

正常情况下细胞内Ca2+主要分布于线粒体及肌浆网中。脑缺血时脑血流中断，供氧减少，大脑在缺氧状态下ATP 生成减少，线粒体功能障碍，使Na+/K+/ATP 酶等离子通道无法维持正常的电化学梯度，导致胶质细胞和神经细胞持续去极化[19]，致使电压门控通道持续开放，细胞内浓度升高；细胞外基质内谷氨酸因再摄取而蓄积，过量的谷氨酸与突触后神经元上N-甲基-D-天冬氨酸和腺苷酸等离子受体结合，引起Ca2+大量内流，造成兴奋性毒性。持续的Ca2+内流导致磷脂酶和蛋白酶的激活，诱导ROS 的生成、细胞膜破坏，细胞外液进入细胞内部，导致细胞毒性水肿并最终造成细胞坏死[20]。在缺血期和再灌注期，Ca2+超载使超氧阴离子自由基及其他氧自由基升高，Ca2+超载仅是触发因素，而后续L 型钙通道的持续下调可能是迟发性神经元死亡的原因之一[21]。

2.4 线粒体自噬

线粒体动力学（线粒体分裂、线粒体融合和线粒体自噬）在线粒体稳态调控中起关键作用，调节线粒体动力学的机制与线粒体自噬的启动密切相关[22]，机体可选择性通过自噬消除受损线粒体，恢复线粒体功能稳态[23]。细胞凋亡或饥饿时，线粒体通过有丝分裂进行降解与再循环，这是线粒体自噬的特殊形式，可分为泛素依赖途径和受体依赖途径[24]。

泛素依赖途径通过线粒体泛素化，使受损线粒体被吞噬并通过溶酶体降解去除。目前该途径研究重点集中在调节PINK1/Parkin 通路上。线粒体损伤导致线粒体膜电位破坏，使PINK1 在OMM 表面堆积，进行PINK1 招募并激活磷酸化PINK1 泛素样域中的Parkin，使其聚集到受损的线粒体中[25-26]。Parkin 激活导致OMM 上的驻留蛋白发生泛素化级联效应，线粒体表面泛素信号增加，激活泛素-蛋白酶体系统降解OMM 蛋白及自噬受体蛋白，使自噬细胞发育[27]。自噬由一组被称为自噬相关（autophagy-related gene，Atg）蛋白的核心蛋白驱动，Atg 蛋白控制自噬体的启动，随后展开其双膜结构包裹溶酶体降解所用的细胞质内容物[28]。此外，有研究表示作用于上游或独立于PINK1激活的泛素特异性蛋白酶30，能通过去泛素化OMM蛋白与调节神经元中的PINK1/Parkin 通路，起到适度有丝分裂及吞噬作用[29]。

受体依赖途径主要通过腺病毒E1B 相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B19kDa interacting protein 3，BNIP3）/NIP 样蛋白X（NIP-like protein X，NIX）信号通路实现，Bcl2/BNIP3 和NIX 的相互作用蛋白被认为参与了缺氧诱导的有丝分裂。早期对这些蛋白作用的研究主要集中在细胞凋亡上，NIX 与BNIP3 有约50%的同源性，两者均位于OMM 上，含有一个非典型的Bcl2 同源3 结构域，并且具有主要的细胞质N-末端[30-31]。NIX 是一种自噬受体，在线粒体损伤后和红细胞分化过程中介导线粒体清除。当线粒体受到压迫时，NIX 和微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的相互作用增加，靶向线粒体进入自噬体降解[32]。过去对BNIP3 研究主要针对其激活Bax 或Bak 细胞介导线粒体功能障碍方面[33]。近期研究发现BNIP3 具有激活线粒体自噬和诱导死亡的功能，参与线粒体自噬的多个调控过程[34]。BNIP3 过表达诱导广泛自噬，其中线粒体被认定为“货物”，当被缺氧情况或羰基氰化物间氯苯腙激活时，BNIP3 表达量增加，BNIP3 二聚化导致LC3B 募集，从而促进选择性线粒体清除，实现自噬[35]。

脑缺血/再灌注后造成脑内缺氧环境，致使线粒体无法正常合成ATP，与此同时线粒体膜电位下降，为维持线粒体膜电位稳定，线粒体消耗ATP 大幅增加。细胞内ATP 浓度降低与AMP 因能量损耗而减少使AMP 活化蛋白激酶活性增强，其激活抑制mTOR 活性，从而上调自噬[36]。此外，在脑缺血后的再灌注时期，受之前缺血缺氧影响，脑神经元中的线粒体结构与功能稳态失衡，所以当血流再灌注时，所带来的氧气除为细胞供能外，也同时产生了大量ROS。过量的ROS 直接损伤线粒体，使线粒体应对氧化应激的能力减低，影响细胞氧化还原稳态，且能开放mPTP，导致线粒体肿胀，启动线粒体自噬[37]。缺血/再灌注发生后不仅细胞能量缺失，ATP 通道受损，细胞内Ca2+也随之升高，线粒体吸收Ca2+浓度增加，从而影响线粒体代谢，造成线粒体肿胀、崩解，促进细胞色素C 释放，最终导致细胞凋亡，所以启动线粒体自噬清除受损线粒体以保护神经细胞[38]。但目前对于线粒体自噬在脑缺血/再灌注中发挥的作用还没有统一答案，综合近期多数研究还是表明线粒体自噬过程对于脑缺血/再灌注损伤，在一定程度上具有神经保护作用[39-41]。

3 小结

脑卒中是一个复杂的病理生理过程，恢复血流后的脑缺血/再灌注损伤不可避免。线粒体不仅在能量代谢中起关键作用，而且对神经元细胞凋亡也有重要影响。脑缺血后失血失氧状态会导致线粒体功能稳态失衡。过量ROS 产生的氧化应激导致线粒体结构和功能的损伤，细胞抗氧化能力失常，无法清除自由基而致细胞死亡。线粒体内钙超载以及氧化应激可通过脂质过氧化、损伤线粒体呼吸链等导致mPTP 的大量开放，使线粒体膜电位下降，释放细胞色素C 等物质，继而活化Caspase-9，并向下活化凋亡执行蛋白Caspase-3，最终导致神经元凋亡。脑缺血/再灌注损伤后，Ca2+的大量内流导致钙超载，而钙超载是导致细胞死亡的重要因素。机体在脑缺血后可选择性通过自噬的受体依赖途径及泛素依赖途径消除受损线粒体，使其恢复功能稳态。因此保护线粒体结构和功能是脑缺血/再灌注损伤后神经元保护的重点。但对其作用机制间的相互作用及有效干预措施的研究尚不完善，相信随着对脑缺血/再灌注损伤后线粒体结构与功能稳态失衡研究的不断深入，以线粒体为作用重点的治疗方法将为脑卒中的发生、发展提供新的防治思路及方法。