两种初加工方法当归饮片中不同提取成分的指纹图谱分析*

李冬华，张 平，张明童，杨 静，马 潇，宋平顺，杨平荣

1 甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州730070；2 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室

随着中药材种植规范化在甘肃的大力推广，初加工方法也开始受到重视。控温控湿干燥法，即分阶段，机械化控制温度与湿度，最终达到对某种中药材快速干燥，易于贮藏，方便炮制，且不添加任何有害化学物质的现代化加工方法［1-5］。特征指纹图谱是指某种药材中所共有的、具有特异性的某类或数类成分的色谱或光谱的谱图，目前已成为控制中药或天然药物质量的有效手段［6-7］。本实验考察了两种初加工方法所生产的当归饮片中挥发油成分、醇提取成分以及水提取成分的指纹图谱，兼顾了当归的亲脂性、中等极性和亲水性的化学成分，可以比较全面的比较不同初加工方法的当归饮片的成分特征［8-14］。

1 仪器与试药

1.1 仪器GC-2010 plus 型气相色谱仪（日本岛津），Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）。甲醇、甲酸、乙酸、二甲苯均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，德国默克公司），阿魏酸（批号：110773-201012）及藁本内酯（中国食品药品检定研究院，批号：111737-201608，批号：111737-201608）。

1.2 试药实验所测不同初加工方法的当归饮片样品，经甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 根的净制切片。其初加工方法与来源见表1。

表1 不同初加工方法的当归饮片来源

2 当归挥发油气相色谱指纹图谱比较

2.1 色谱条件色谱柱：DB-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：氮气，流速1 mL/min；程序升温：初始温度60℃，以3℃/min升至250℃，保持16 min；进样口温度230℃；氢火焰（FID）检测器，温度260℃，分流比为1∶50，进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的制备取藁本内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备按2015 年版《中华人民共和国药典》中挥发油提取方法［15］，取当归饮片粉末50 克置于圆底烧瓶中，加水300 mL，加数片沸石，连接挥发油测定器，自测定器上端入口处加适量水，精密加1 mL二甲苯，连接冷凝管，蒸馏8 h，停止加热，冷却半小时后收集油层，0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得当归挥发油供试品溶液。

2.4 精密度考察取同一批当归饮片挥发油供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.26%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.00%～0.48%。表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性考察取同一批当归饮片6 份，制备挥发油供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.66%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.00%～1.03%。表明该分析方法的重复性良好。

2.6 稳定性考察取同一批当归饮片挥发油供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12 和24 h 进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：1.15%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.00%～1.15%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 当归饮片挥发油指纹图谱的建立及比较分别精密吸取各供试品溶液1 μL，进样分析，得到指纹图谱并统一处理，导出cdf 文件，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，进行图形匹配及数据匹配，建立供试品指纹图谱，计算相似度并比较，见图1—2。16 批次供试品相似度在0.986～1.000 之间，比较传统烟熏干燥法的供试品1～8所生成的对照图谱与现代控温控湿干燥法的供试品9～16 所生成的对照图谱，二者相似度为0.998。表明两种初加工方法所生产的当归饮片中挥发油成分相似度高，明显差别。见表2—3。

图1 不同初加工方法的当归饮片挥发油气相指纹图谱

图2 不同初加工方法的当归饮片挥发油气相指纹图谱比较

表2 不同初加工方法的当归饮片挥发油气相指纹图谱相似度

表3 不同初加工方法的当归饮片挥发油气相指纹图谱相似度比较

3 当归饮片甲醇提取成分液相色谱指纹图谱比较

3.1 色谱条件C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：乙腈（A）-1%乙酸水溶液（B）梯度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温25℃；检测波长280 nm；进样量10 μL，见表4。

表4 流动相梯度洗脱表

3.2 对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，即得；取藁本内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备取当归饮片粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-甲酸（95∶5）溶液25 mL，密塞，称定质量量，超声处理（功率250W，频率40 kHz）60 min，放冷，用甲醇-甲酸（95∶5）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 精密度考察取同一批当归饮片甲醇提取溶液，按“3.1”项下色谱条件，连续进样6 次，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.32%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.05%～0.75%。表明仪器的精密度良好。

3.5 重复性考察取同一批当归饮片6 份，制备甲醇提取溶液，按“3.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.86%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.06%～1.35%。表明该分析方法的重复性良好。

3.6 稳定性考察取同一批当归饮片甲醇提取溶液，按“3.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12和24 h 进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：1.65%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD在0.08%～1.55%。表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。

3.7 当归饮片甲醇提取成分指纹图谱的建立及比较分别精密吸取各批供试品溶液10μL，进样分析，得到各指纹图谱，统一处理后，导出cdf 文件，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，进行图形匹配及数据匹配后，建立供试品指纹图谱，计算相似度，并进行比较。见图3—4。

16 批次供试品相似度在0.921～0.998 之间，传统烟熏干燥法的供试品1～8 所生成的对照图谱与现代控温控湿干燥法的供试品9～16 所生成的对照图谱进行比较，二者相似度为0.987。均表明两种初加工方法所生产的当归饮片中醇溶性成分相似度高，没有明显差别。见表5—6。

表5 不同初加工方法的当归饮片甲醇提取成分液相指纹图谱相似度比较

表6 不同初加工方法的当归饮片甲醇提取成分液相指纹图谱相似度

图3 不同初加工方法的当归饮片甲醇提取成分液相指纹图谱

图4 不同初加工方法的当归饮片甲醇提取成分液相指纹图谱比较

4 当归饮片水提取成分液相色谱指纹图谱比较

4.1 色谱条件与“3.1”项下色谱条件一致。见表4。

4.2 对照品溶液的制备与“3.2”项下对照品溶液的制备一致。

4.3 供试品溶液的制备取当归饮片粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水-甲酸（95∶5）溶液25 mL，密塞，称定质量，煮沸并保持微沸60 min，放冷，用水-甲酸（95∶5）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.4 精密度考察取同一批当归饮片水提取溶液，按“3.1”项下色谱条件，连续进样6 次，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.43%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.05%～0.88%。表明仪器的精密度良好。

4.5 重复性考察取同一批当归饮片6 份，制备水提取溶液，按“3.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：0.82%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD 在0.06%～1.69%。表明该分析方法的重复性良好。

4.6 稳定性考察取同一批当归饮片水提取溶液，按“3.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12 和24 min 进样，记录色谱图。结果指纹图谱相似度的RSD：1.22%；各主要色谱峰的相对保留时间RSD在0.08%～1.68%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

4.7 当归饮片水提取成分指纹图谱的建立及比较分别精密吸取各批供试品溶液10 μL，进样分析，得到各指纹图谱，统一处理后，导出cdf 文件，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，进行图形匹配及数据匹配后，建立供试品指纹图谱，计算相似度，并进行比较。见图5—6。

16 批次供试品相似度在0.717～0.995 之间，表明个别供试品之间水溶性成分存在一定的差异，但传统烟熏干燥法的供试品1～8 所生成的对照图谱与现代控温控湿干燥法的供试品9～16 所生成的对照图谱进行比较，二者相似度为0.936，表明两种初加工方法所生产的当归饮片中水溶性成分较为相似，没有明显差别。见表7—8。

图5 不同初加工方法的当归饮片水提取成分液相指纹图谱

图6 不同初加工方法的当归饮片水提取成分液相指纹图谱比较

表7 不同初加工方法的当归饮片水提取成分液相指纹图谱相似度

表8 不同初加工方法的当归饮片水提取成分液相指纹图谱相似度比较

5 小结

本实验以阿魏酸对照品和藁本内酯对照品作为参照物，利用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行分析，对两种初加工方法，即传统烟熏干燥法和现代控温控湿干燥法，所生产的当归饮片中挥发油成分、醇溶性成分和水溶性成分进行了指纹图谱的比较，其相似度分别为0.998、0.987、0.936，表明两种初加工方法所生产的当归饮片整体化学特征较为近似，所含成分没有明显差别，不会影响其质量和功效。考虑到环境保护和现代规模化生产模式，应该提倡现代控温控湿干燥法作为新型初加工方法，并加以推广。