基于NF-κB/IRF4 信号通路研究龙葵总碱抗小鼠浆细胞骨髓瘤的作用*

刘 凯，王 跃，聂 甜，郝敬全，黄 蓉，江劲波

湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙410208

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种恶性浆细胞肿瘤，是一种病死率较高的难治性血 液 恶 性 肿 瘤［1］。 西 医 采 用 以 硼 替 佐 米（bortezomib，BTZ）、来那度胺为基础的诱导/巩固化疗方案可最大程度地降低肿瘤负荷，或联合造血干细胞移植以提高患者的远期生存［2］。但是，部分患者易在维持治疗阶段复发或远期复发。中医药对该病的防治取得了一些初步疗效。大量研究表明［3］，龙葵总碱（龙葵的提取物）对于多种肿瘤有明确的增殖抑制作用。本课题组前期使用含龙葵的中药复方治疗MM，患者远期生存率有所提高［4］。龙葵总碱是从龙葵中分离出的活性生物碱，在MM 中的治疗中发挥着较大作用。本研究从NF-κB/IRF4 信号途径促进骨髓瘤细胞凋亡为切入点，运用蛋白免疫印迹等分子生物学方法，研究龙葵总碱对NF-κB/IRF4 信号途径各信号靶点分子的作用，以期阐明龙葵总碱促骨髓瘤细胞凋亡的作用机制，为MM 维持阶段的新药开发提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物4周龄SPF级BALB/c裸鼠90只，体质量15～20 g，均为雌鼠，购自上海宝特生命科学发展有限公司，实验动物许可证号：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 药物与试剂RPMI-8226 骨髓瘤细胞株（武汉兴旺生物科技有限公司，批号：5078）；硼替佐米注射剂（西安杨森制药有限公司，批号：160823591，规格：1.0 mg/支）；龙葵总碱（芜湖甙尔塔医药科技有限公司，批号：20170602）；RPMI1640 培养基（Gibco 公司，批号：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco 公司，批号：SH30070）；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：C1062M）；彩色预染蛋白marker（江苏碧云天，批号：P0078），RIPA蛋白裂解液产品来（Fermentas，批号：P0013E），Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天有限公司，批号：P0006）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（南京诺维赞生物科技有限公司，批号：ab9810）；NF-κB（P65）转录因子试剂盒（ImmunoWay，批号：YT2306）；人IκB激酶-α（inhibitor kappa-B alpha，IκB-α）试剂盒（Immuno Way，批号：YT2417）；人磷酸化IκB 激酶-α（p-IκB-α）试剂盒（批号：ImmunoWay，YP0151）；干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）试剂盒（ImmunoWay，批号：YP0151）；人β 肌动蛋白（β-actin）试剂盒（Abcam，批号：ab8226）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将RPMI-8226 骨髓瘤细胞株加入含10%胎牛血清加双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L）的RPMI 1640 培养液内，置于5% CO2及37℃饱和湿度培养箱中培养。

1.3.2 造模与分组

1.3.2.1 造模 除空白组外，其余各组裸鼠均采用刘瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，通过传代，扩增，收集呈对数生长期的细胞制成单细胞悬液，SPF 环境下在每只裸鼠右前肢外侧皮下接种细胞悬液6×105/0.2 mL。造模成功的标准：取瘤组织进行病理检测，HE染色后见大量原始、幼稚浆细胞聚集分布，免疫组织化学染色后见浆细胞CD138（+）或κ轻链（+），血清免疫固定电泳检测到M蛋白。

1.3.2.2 分组 以非造模裸鼠为空白组，模型组随机分成5 组。空白组［生理盐水10 mL/（kg·d），灌胃］，模型组［生理盐水10 mL/（kg·d），灌胃］，硼替佐米组［硼替佐米0.1 mg/（kg·d），皮下注射］，龙葵总碱高［龙葵总碱50 mg/（kg·d），灌胃］、中［龙葵总碱25 mg/（kg·d），灌胃］、低［龙葵总碱12.5 mg/（kg·d），灌胃］剂量组，每组15只。连续灌胃14 天（20 g 小鼠龙葵的累及致死量为30 mg）［4］；连续皮下注射14天，每日2次，每次0.1 mL。

1.3.3 CCK8 检测细胞增殖抑制率 先将模型组小鼠的新鲜瘤体组织剪成1～2 mm2大小，放入组织研磨器中加入1～2 mL 生理盐水；转动研磨，研至匀浆；加入10 mL生理盐水，冲洗研磨器；离心后收集瘤细胞悬液，弃上清，先用预冷PBS 收集细胞，再用改良型1640 培养基将细胞密度调整至1×105个/mL，每孔50 μL 接种于96 孔培养板（即每孔0.5×104个/mL），即在RPMI8226 细胞中所需浓度为：分别设空白组（仅有培养基）、对照组（50 μL 培养基+50 μL 细胞）、药物组（50 μL 龙葵总碱+50 μL 细胞），在药物组分别加入50 μL 已配置的不同浓度龙葵总碱（50 mg/L、25 mgl/L、12.5 mg/L），每个浓度设5 个复孔，种于96 孔板，置于37℃、5%C02饱和湿度培养箱培养24～72 h。每孔加入10 μL 试剂盒中7sea-cell counting kit 溶液，同步设调零孔，继续培养2 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光值（OD）。

1.3.4 流式细胞分析法检测细胞凋亡率 同上取瘤组织细胞，加入500 μL的Binding Buffer至悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后，加入5 μL Propidium Iodide（PI），混匀；室温、避光、反应5～15 min；在1 h之内进行流式细胞仪的观察和检测。

1.3.5 采用Western blot检测p-IκB-α、NF-κB、P65 与IRF4 表达量 把组织块放入匀浆器内，用干净的剪刀尽量剪碎。剪碎匀浆器内的组织，加入RIPA 裂解液，尽量碾碎组织，30 min 后用移液器移至1.5 mL 离心管中，匀浆器内加入适当RIPA裂解液（含1%PMSF），置于冰上进行匀浆。每20 mg组织加入0.15～0.25 mL裂解液。4℃条件下，离心半径：13.5 cm，12 000 r/min，离心5 min，取细胞全蛋白即上清液，分装于1.5 mL离心管中，-20℃保存，采用Bradford 法测定蛋白质含量（制作标准曲线和检测样品蛋白含量），采用SDS-PAGE 凝胶电泳（清洗玻璃板和灌胶与上样），后在PVDF 膜上垫3张滤纸，然后将凝胶平铺于PVDF 膜上，加入用封闭液稀释的一抗，25℃孵育1 h，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗体，同样用封闭液稀释，稀释比为1∶2000，37℃孵育1 h。再次洗膜后通过显色仪器进行ECL 显影。采用美国Bio-RadChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统，成像图片利用图像分析软件IPP 6.0，对图像进行累积光密度（IOD）分析。

1.4 统计学方法采用SPSS 24.0 软件进行数据处理与分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析；计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓瘤细胞增殖活性与模型组比较，硼替佐米组，龙葵总碱高、中、低剂量组对骨髓瘤细胞抑制率均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与龙葵总碱低剂量组比较，硼替佐米组、龙葵总碱高剂量组对骨髓瘤细胞的抑制率均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；硼替佐米组与龙葵总碱高剂量组对骨髓瘤细胞的抑制率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；硼替佐米组，龙葵总碱高、中、低剂量组在48 h与72 h时对骨髓瘤细胞的抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示龙葵总碱具有明显的抑制增殖效应，且呈时间依赖性。见表1。

2.2 骨髓瘤细胞凋亡与模型组比较，硼替佐米组，龙葵总碱高、中、低剂量组瘤细胞凋亡率均增高（P＜0.05）。与龙葵总碱低剂量组相比较，硼替佐米组、龙葵总碱高剂量组瘤细胞凋亡率均增高（P＜0.05）。龙葵总碱高剂量组与硼替佐米组比较，瘤细胞凋亡率无差异（P＞0.05），提示龙葵总碱具有明显的促细胞凋亡作用，且呈剂量依赖性。见表2、图1。

2.3 骨髓瘤细胞p-IκB-α、NF-κB.P65 与IRF4 表达与模型组比较，硼替佐米组、龙葵总碱高、中剂量组p-IκB-α、NF-κB与IRF4表达均减少（P＜0.05），而其负调控因子IκB-α 水平升高（P＜0.05）。与龙葵总碱低剂量组比较，龙葵总碱高剂量组、硼替佐米组瘤细胞p-IκB-α、NF-κB P65 与IRF4 表达均减少（P＜0.05）。与硼替佐米组比较，龙葵总碱高剂量组瘤细胞p-IκB-α、NF-κB、p65 与IRF4 表达差异无统计学意义（P＞0.05），提示龙葵总碱抑制骨髓瘤细胞IκB-α 磷酸化，引起NF-κB 失活，减少瘤细胞IRF4 表达，说明龙葵总碱能通过抑制IκB-α 磷酸化和NF-κB/IRF4信号通路促进骨髓瘤细胞凋亡，且呈剂量依赖性。见表3、图2。

表1 各组小鼠骨髓瘤细胞增殖活性比较（±s） %

表1 各组小鼠骨髓瘤细胞增殖活性比较（±s） %

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；与硼替佐米组比较，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；与龙葵总碱低剂量组比较，●表示P＜0.05

组别模型组硼替佐米组龙葵总碱低剂量组龙葵总碱中剂量组龙葵总碱高剂量组鼠数15 15 15 15 15 48 h 72 h抑制率（%）1.12±0.74 27.38±1.67#●11.59±1.79*Δ 16.77±1.53#Δ 28.61±2.98#○●吸光度0.717±0.006 0.574±0.015 0.689±0.033 0.624±0.021 0.569±0.018抑制率（%）0.89±0.26 19.89±2.13*●3.79±4.57*Δ 6.58±3.52*Δ 20.61±2.54#○●吸光度0.748±0.006 0.547±0.012 0.587±0.013 0.569±0.009 0.534±0.022

表2 各组小鼠RPMI-8226骨髓瘤细胞凋亡率比较（±s）

表2 各组小鼠RPMI-8226骨髓瘤细胞凋亡率比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05；与硼替佐米组比较，Δ表示P＜0.05，○表示P＞0.05；与龙葵总碱低剂量组比较，●表示P＜0.05

凋亡率0 13.4±2.14 41.5±2.78*●24.8±0.74*Δ 33.2±1.49*Δ 46.7±0.97*○●组别空白组模型组硼替佐米组龙葵总碱低剂量组龙葵总碱中剂量组龙葵总碱高剂量组鼠数15 15 15 15 15 15

表3 各组小鼠瘤组织细胞蛋白相对含量比较（%）

图1 各组小鼠骨髓瘤细胞凋亡率（Q2和Q3为凋亡细胞）

图2 各组小鼠β-actin、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、P65、IRF4表达

3 讨论

MM 的自然病程个体差异较大，具有明显差异性［6-7］，且尚无法治愈，临床治疗的目的是实现严格的完全缓解、分子水平缓解，减少其复发、改善其生存质量。

中医学在治疗MM 方面具有独特的优势，多发性骨髓瘤依据其临床症状，可将其归属于中医学“骨痹”“骨蚀”等范畴。中药龙葵（solanum nigrum）具有软坚散结的作用，龙葵总碱（生物碱）是龙葵抗肿瘤的主要成分，对胃癌、肝癌、白血病等具有广泛的抗肿瘤活性［8-9］。

前期研究表明，NF-κB 信号通路激活是骨髓瘤细胞凋亡受抑的重要机制［10-12］。在NF-κB 信号通路中，其活化与IκB 激酶（IκB kinase，IKK）起了决定性的作用，在上游各种活化信号的刺激下，IKK 激酶复合物中的IKKγ作用于下游的IκB-α，将其磷酸化后降解IκB-α，从而释放出NF-κB，NFκB 活化后在核定位信号的介导下转位入核，启动下游靶基因的活化。而IRF4 是NF-κB/IRF4 信号通路下游重要的靶基因［13］，在多发性骨髓瘤细胞中，IRF4 基因过度表达，使得患者体内肿瘤性浆细胞负荷增高［14］。

在本实验中，将不同浓度的龙葵总碱干预骨髓瘤小鼠进行瘤组织分离，并予以NF-κB、P65、IRF4、IκB- α、p-IκB- α 蛋 白 的 提 取 并 进 行Western blot 方法检测蛋白，结果提示龙葵总碱处理后细胞中NF-κB P65、IRF4、p-IκB-α 蛋白表达量明显降低，而负调控因子IκB-α 水平明显升高，其机制为下游的IκB-α 蛋白被磷酸化后降解IκB-α，从而释放出NF-κB，NF-κB活化后在核定位信号的介导下转位入核，启动下游靶基因的活化，IRF4是NF-κB/IRF4信号通路下游重要的靶基因，入核后的NF-κB 可与IRF4 基因的启动子结合，增加IRF4 基因的转录这说明龙葵总碱对于多发性骨髓瘤细胞的促凋亡作用与转录因子IRF4 蛋白和NF-κB 家族中的主要调控抑制凋亡蛋白P65 的下调有关。

综上所述，龙葵总碱通过抑制磷酸化IκB-α，引起NF-κB失活，促进骨髓瘤细胞IRF4表达减少，从而促使骨髓瘤细胞凋亡，其促骨髓瘤细胞凋亡和抗骨髓瘤细胞增殖效应呈剂量与时间依赖趋势。本研究为更全面地阐释龙葵总碱抗多发性骨髓瘤的作用机制，及进一步为寻找中药治疗MM 的作用靶点研究提供了客观的实验依据。