单纯疱疹病毒2型gD蛋白-结核杆菌热休克蛋白70 DNA疫苗的免疫效应研究

樊建勇，田 晨，王兴旺，张功恺，高 睿，籍丽玥，陈韦君，杨慧兰

生殖器疱疹（GH）是由单纯疱疹病毒(HSV)感染泌尿生殖器及肛周皮肤黏膜而导致的一种慢性、复发性、难治愈的性传播疾病[1]。在病毒感染性疾病的防治中，疫苗是有效的治疗方法。HSV糖蛋白是HSV的主要免疫原，按照HSV糖蛋白引起的抗体反应及保护性免疫分析，其免疫原性强弱顺序为：gD，gB，gC，gE，gG，gI，gH。作为抗 HSV 感染中重要的保护性抗原，gD能抑制潜伏感染的发生[2]，其具有成为HSV疫苗研究靶点的优势。笔者以往构建的HSV2gD DNA疫苗由于免疫原性较弱，所以需要通过联合抗原载体分子或免疫佐剂来增强其免疫激活作用[3]。结核杆菌热休克蛋白70（Hsp70）具有强的免疫原性，有免疫佐剂的作用，能增强抗原诱导机体产生细胞免疫和体液免疫的能力[4]。本研究使用实验室自行构建的HSV2型gD蛋白、结核杆菌热休克蛋白70（Hsp70-HSV2gD）DNA疫苗[5]免疫BALB/c小鼠，研究其对小鼠免疫反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验小鼠雌性BALB/c鼠，5周龄,购于南方医科大学动物中心。

1.1.2 实验试剂 羊抗gD多抗（SANTA CRUZ），兔抗羊HRP-IgG抗体（广州威佳公司），FITC标记CD4+、CD8+，PE标 记CD3+细胞单克隆抗体（Invitrogen公司）；MTT（Sigma公司）；干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-4、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（湖北武汉博士德公司），1640培养液、胎牛血清等（广州威佳公司）。pVAX-gD、pVAXHsp70和pVAX-Hsp70- HSV2gD质粒由本实验室自行构建保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫动物 40只雌性Balb/c小鼠随机分为4组，每组10只：第1组：注射pVAX空质粒组，第2组：注射pVAX-HSV2gD组，第3组：注射pVAXHSV2gD+pVAX-Hsp70组（pVAX-HSV2gD质粒和pVAX-Hsp70质粒混合注射），第4组：注射pVAXHsp70-HSV2gD组[3]。4组小鼠均于双侧胫前肌注射，总容量为100 μl (1 μg/μl)的各种质粒DNA溶液，每周免疫1次，共3次。最后1次注射后4周，取小鼠血清及处死后取脾细胞用于实验研究。

1.2.2 血HSV-2gD抗体的测定 免疫完成后从小鼠眼眶取血，用ELISA法测定小鼠血清中HSV-2gD IgG。以HSV-2gD为包被抗原，实验小鼠血清为一抗，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，显色后用酶标仪波长450 nm测OD值。

1.2.3 检测脾细胞培养上清IFN-γ、IL-4浓度小鼠颈椎脱臼处死，分离脾，制备单细胞悬液，分别用200目、400目丝网过滤细胞悬液，重悬淋巴细胞调整浓度为5×106/ml。100 μl细胞悬液加入96孔板，再加入50 μl（10 µg/ml）的HSV-2gD糖蛋白，细胞培养72 h后，离心后取上清测定IFN-γ、IL-4浓度。

1.2.4 小鼠脾细胞增殖测定100 μl终浓度为5 ×106/ml的脾淋巴细胞加入96孔板，再加入50 μl（10µg/ml）的 HSV-2gD蛋白，培养72 h后，加入 20 μl MTT，37℃温育4 h，离心去上清，加入150 μl 二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪490 nm测定，脾细胞增殖刺激指数(SI) =A490实验孔/A490点对照孔。

1.2.5 检测CD4+、CD8+T细胞亚群 取脾细胞悬液0.6 ml（5×106/ml）加入EP管，500×g离心5 min，1 ml洗液洗涤脾淋巴细胞3次，然后分为相等的2份，一份加入PE-CD3+单抗、FITC-CD4+单抗50 μl，另一份加入PE-CD3+单抗、FITC-CD8+单抗50 μl，4℃反应30 min，再次用1 ml洗液洗涤脾淋巴细胞3次，各加入0.5 ml保存液，流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 gD抗体测定

测定结果表明，gD组、gD+Hsp70组和Hsp70-gD核酸疫苗组血gD特异性抗体浓度较pVAX空质粒组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；Hsp70-gD组血清特异性抗体浓度较gD+Hsp70组、gD组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明疫苗免疫小鼠后可诱导gD抗体的产生，Hsp70-gD疫苗组比gD+Hsp70组、gD组能更好地诱导小鼠产生特异性gD抗体（图1）。

图1 血HSV-2gD IgG抗体检测水平

2.2 培养上清中IL-4的测定

IL-4可作为一个反映体液免疫水平的指标。gD组、gD+Hsp70组 和Hsp70-gD组IL-4浓度高于pVAX组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Hsp70-gD组的IL-4浓度较gD+Hsp70组和gD组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示gD、gD+Hsp70、Hsp70-gD DNA疫苗免疫小鼠后均可诱导体液免疫应答，Hsp70-gD诱导小鼠产生的体液免疫效应比gD+Hsp70、gD更强（图2）。

图2 脾淋巴细胞培养上清中IL-4的检测水平

2.3 培养上清中IFN-γ的测定

IFN-γ可作为一个反映细胞免疫水平的指标。gD组、gD+Hsp70组 和Hsp70-gD组IFN-γ水平高于pVAX组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Hsp70-gD组IFN-γ水平高于gD+Hsp70组、gD组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的检测水平

2.4 脾细胞增殖刺激指数（SI）检测

淋巴细胞的刺激增殖反应能力是细胞免疫应答的一个重要指标。结果显示，gD组、gD+Hsp70组和Hsp70-gD疫苗组比pVAX组的脾细胞SI指数高，差异有统计学意义（P＜0.05）；Hsp70-gD疫苗组的脾细胞SI指数高于gD+Hsp70组、gD组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 免疫小鼠脾淋巴细胞SI测定

2.5 CD4+、CD8+ T细胞亚群的检测

gD组、gD+Hsp70组 和Hsp70-gD组CD4+T细胞与CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞比值均高于pVAX空质粒组。Hsp70-gD组CD4+T细胞亚群测值、CD8+T细胞亚群测值高于其他3组，而且差异有统计学意义（P＜0.05），但gD组、gD+Hsp70组和Hsp70-gD组的CD4+/CD8+T细胞比值差异无统计学意义（表1）。

表1 CD4+、CD8+ T细胞亚群测定结果 （±s）

表1 CD4+、CD8+ T细胞亚群测定结果 （±s）

注：与 pVAX组比较，a P＜0.05；与pVAX- HSV2gD和pVAX-HSV2gD+pVAXHsp70组比较，bP＜0.05

组 别 CD4+T细胞(%)CD8+T细胞(%)CD4+T细胞/CD8+T细胞pVAX 12.48±1.32 8.52±0.82 1.47±0.13 pVAX- HSV2gD 19.96±1.67a 11.97±1.13a 1.67±0.10a pVAX-HSV2gD 20.58±1.63a 12.20±1.12a 1.69±0.13a+pVAX-Hsp70 pVAX-Hsp70-26.36±2.36ab 15.46±1.25ab 1.72±0.13a HSV2gD

3 讨论

DNA疫苗也就是人们常说的核酸疫苗或基因疫苗，就是用含有编码蛋白翻译需要的全套调控元件的质粒核酸，通过注射等方式导入动物体内，诱导免疫动物产生靶向该序列编码蛋白质的免疫反应。DNA疫苗有以下优点：①制备简便；②导入的疫苗基因长期持续表达，免疫功能维持时间长久；③疫苗表达的抗原蛋白与自然状态更相似[6,7]。已有文献证实，核酸疫苗有很好的免疫原性，既可以保护机体避免初次感染，起到预防作用，又可以降低已感染者的复发率[8-10]。虽然DNA疫苗可以诱发免疫应答，但在研究中也发现单独采用某一抗原刺激机体出现的免疫效应较弱，为了解决这一问题，常使用的方法就是抗原蛋白联合适当的免疫佐剂，从而达到增强抗原蛋白的免疫激活效应，特别是增强在抗病毒免疫中发挥主要作用的细胞免疫活性[11]。

HSV-2由30多种蛋白组成病毒结构蛋白，这些蛋白在保护病毒核酸、病毒对机体的致病过程和刺激机体产生免疫反应中发挥作用。其中，被认为有免疫原性并能诱发免疫保护作用的是病毒的gD蛋白。该蛋白在HSV-2增殖和刺激机体产生中和抗体的过程中起着重要的作用，是机体发挥体液免疫及细胞免疫效应的一个主要靶点。Hsps存在于所有的真核细胞和原核细胞中，其结构高度保守。研究表明[12-15]，Hsp70免疫原性强，可作为较理想的免疫佐剂，其可能机制有：①Hsps可以作为一种免疫“危险”信号，直接刺激机体免疫反应。因此，无论是细菌的Hsps或者由于细胞的损伤而释放的自身的Hsps均能刺激免疫系统产生炎症反应。②从细胞中释放的Hsp-多肽复合物，能够被抗原提呈细胞（APC）捕获，激活特异性T淋巴细胞反应，从而诱发有效的免疫效应。尽管大多数外源性的抗原进入主要组织相容性复合物（MHC）-Ⅱ类分子途径，从而激活CD4+T细胞反应，但是Hsps-肽段复合物能够诱导机体产生特异性的CD8+T细胞反应，说明Hsp-肽段复合物能够进入MHC-Ⅰ类分子提呈途径。因此，Hsps-肽段复合物的免疫刺激作用必须依赖于APC。这些研究结果也提示将外源性抗原传递进入内源性抗原加工途径可能是Hsps的一种特殊功能，从而诱发更强的细胞免疫效应。

在 本 实 验 中 用pVAX-gD、pVAX-Hsp70和pVAX-Hsp70-gD免疫小鼠后，pVAX-gD组、pVAXgD+ pVAX-Hsp70组和pVAX-Hsp70-gD组均可以诱导小鼠产生靶向HSV-2gD蛋白的抗体，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖并在培养上清中产生IFN-γ、IL-4，刺激CD4+T细胞与CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞比值升高。其中，pVAX-Hsp70-gD疫苗组在血清HSV-2gD蛋白抗体产生水平升高，脾淋巴细胞SI、培养上清中IFN-γ和IL-4浓度均显著高于pVAX-gD组、pVAX-gD+ pVAX-Hsp70组，差异有统计学意义。IFN-γ是Th1型细胞因子，主要介导细胞免疫应答；IL-4是Th2型细胞因子，主要介导体液免疫应答，这两种细胞因子也常作为粗略反映细胞免疫和体液免疫的指标。本研究结果提示，构建的pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗可以诱导免疫小鼠产生有效的体液和细胞免疫应答，为其在临床的应用打下基础。