微小RNA调控牙髓干细胞成牙本质向分化的研究进展

胡荣荣 王玉良

【关键词】 牙髓干细胞 微小RNA 成牙本质向分化

[Key words] Dental pulp stem cells microRNA Odontogenic differentiation

First-author’s address： School of Stomatology， Binzhou Medical University， Yantai 264000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.045

作为严重威胁人们口腔健康的疾病之一，龋病可继发牙髓炎、根尖周炎，甚至各种颌骨炎症，最终造成牙体缺损、甚至牙体缺失。与其他组织（如骨组织）相比，受损后具有自我修复和重塑的能力，牙体组织则不容易完全再生且修复程度有限[1]。目前，缺损的牙体组织主要依赖口腔充填材料修复，且无法完全恢复牙齿的生物学性能。所以，牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在组织再生领域的相关研究受到越来越多患者及科学家的普遍关注。

DPSCs是一类来源于牙髓组织的间充质干细胞（MSCs），可在活髓组织中分离和培养，有较强的增殖、自我更新能力以及分化为多种细胞的潜能，且容易获得、来源较为丰富、对供体损伤不大、不涉及伦理问题，在组织工程和再生医学领域的应用十分广阔[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）作为内源性RNA，大量存在于生物体内，同时，在转录后相关基因的调控中具有不可替代作用，参与诸多生物发生过程，如细胞发育、分化、增殖和凋亡等[3]。已有文献报道，miRNA参与牙齿的发育和再生[4]。

1 DPSCs

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是外胚层来源的成体干细胞，源于迁移的神经嵴细胞[5]。2000年，由Gronthos等[6]首次分离、鉴定及命名。在体内和体外适宜培养条件下，DPSCs可分化为成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和神经元细胞[7]，其中牙向分化能力在口腔相關研究中非常重要。成骨诱导可显著增强DPSCs的矿化能力，同时以HA/TCP为载体与DPSCs结合，可在小鼠体内产生牙本质/牙髓样复合物[6，8]，以此证明了DPSCs良好的组织再生能力。

2 miRNA

只有1%～2%的RNA分子可翻译成蛋白质，称为编码RNA，大多数是非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）[9]。作为一类重要的ncRNA，miRNA由19～25个核苷酸组成，长度为18～22 nt。最早发现的2个miRNA分别是lin-4和let-7[10-11]，且都存在于线虫体内。miRNA不仅可以降解mRNA的翻译，还能抑制mRNA的翻译，负性调节基因的表达[11]。核酸酶Dicer在miRNA形成过程中发挥重要作用，文献[12]研究报道，条件性敲除小鼠的Dicer1会导致牙齿原有的大小和形状发生改变，这表明牙齿的发育受到miRNA的严格调控。

3 DPSCs和miRNA

3.1 miRNA在DPSCs成牙本质向分化中的作用 miRNA可在转录后水平调节信使RNA（mRNA）向蛋白质翻译，在所有生物活动中发挥关键作用[13]。miRNA具有明显的特异性，即不仅在不同物种、组织及细胞间会有不同的表达;而且在相同物种、组织及细胞发育的不同时期，其表达也不尽相同[14]。吕红兵等[15]指出，与非DPSCs对比，DPSCs中表达超过2倍的miRNA有14个，其中有11个上调和3个下调;同时推测，表达谱的差异可能与细胞干性有关。有研究利用PCR对104种已知miRNA分析发现，与BM-MSCs相比，DPSCs中差异表达的miRNA共有48个，其中上调的19个，下调的29个[16]。Gong等[3]使用微阵列分析来筛选和比较hDPCs牙源性分化过程中miRNA谱的变化，发现有22个miRNA差异表达，其中12个上调，10个下调。

miRNA对于DPSCs成牙本质向分化的调控具有双向作用，它不仅可以促进成牙本质向分化，还可以抑制此过程[9]。研究发现，miR-720在明显降低其增殖能力的同时，可促进DPC成牙本质向分化;同时指出，miR-720将成为DPC分化过程中的新型miRNA[17]。研究利用miR-210模擬物和抑制物调节DPSCs中miR-210的表达，发现上调miR-210可促进DSPP、DMP1 mRNA及蛋白的表达;抑制其表达，则结果相反。从而提示miR-210在DPSCs成牙本质向分化过程中起正向调节作用，不过，其中作用机制需进一步研究[18]。邱在玲等[19]通过慢病毒转染hDPSCs过表达miR-146a-5p，结果显示，过表达组中成牙分化标志物（Dspp、Dmp1）表达显著上调，由此证明miR-146a-5p正向调控hDPSCs牙向分化。Chang等[4]发现miR-218在DPSCs中表达下调，且miR-218模拟物可显著降低DPSCs的增殖和分化能力。吴韫慧等[20]发现，miR-431在DPSCs成牙分化过程中表达下调，同时，成牙分化标志物表达显著上调，推测miR-431负向调控成牙本质向分化。另外，还有较多miRNA正向调节DPSCs牙向分化，如miR-21、miR-223、miR-27a-5p、miR-125a-3p、miR-135b[3，21-24];而miR-143、miR-145、miR-488则可负向调节这一过程[25-26]。

Liu等[25]利用微阵列分析小鼠DPSCs中miRNA的表达，其中，miR-143和miR-145下调最明显，可与KLF4形成调节反馈环抑制Dspp和Dmp1 mRNA及蛋白的表达，从而负向调控牙向分化。成牙本质向分化过程中，这是首个涉及miRNA的反馈环调控报道。Quaking（QKI）是STAR家族的成员之一，作为RNA结合蛋白直接与RNA结合，存在于各种细胞类型中，影响RNA代谢和信号转导。随后的文献[27]研究中发现，QKI不仅可以作为KLF4的竞争性内源RNA（competent endogenous RNA，ceRNA），通过竞争其共有的miRNA（miR-124-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-429）上调KLF4来促进hDPSCs成牙本质向分化，还可作为DSPP mRNA的结合蛋白来促进hDPSCs的成牙本质向分化。

每个miRNA可以靶向调控多个mRNA;同时，每个mRNA也可以由多个miRNA靶向调控。一方面，miRNA在转录后水平抑制或降解mRNA翻译;另一方面，miRNA似乎还具有后续作用，可能通过相应反调节机制发挥其他mRNA水平及蛋白质相互作用[16]。

3.2 miRNA调控DPSCs成牙本质向分化中相关的信号通路 DPSCs成牙本质向分化过程中受多种因素（如miRNA、信号通路等）调控。包括细胞分化在内的诸多生物发生过程都离不开miRNA的参与。已有研究证明，miRNA通过相关信号途径在DPSCs成牙本质向分化中发挥重要作用。

3.2.1 Notch信号通路 邱在玲等[28]发现，上调miR-146a-5p表达后，DPSCs增殖能力下降，然而可显著促进DPSCs分化;反之，则结果相反。利用siRNA-Notch1转染DPSCs来干扰Notch信号，可促进DPSCs分化而抑制其增殖，Notch1作为miR-146a-5p的直接靶点，由此证明，miR-146a-5p可通过Notch1参与调控Notch信号通路，在促进DPSCs分化中发挥重要作用。

3.2.2 NF-κB信号通路 Wang等[23]指出miR-125a-3p可能与龋齿的严重程度呈负相关，在龋齿中，侵入髓腔的病原体通过释放各种炎症因子导致DPSCs中miR-125a-3p表达增加，致使Fyn上调。Fyn与NRP1相互作用形成NRP1-Fyn复合物来激活NF-κB信号通路。结果显示，DPSCs的成牙本质向分化能力降低，炎症反应进一步扩大，最终破坏了正常的牙齿组织致使龋齿更加严重。

3.2.3 MAPK信号通路 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可识别各种胞外部信号，并被激活，在信号向细胞内传导过程中具有重要作用[29]。MAPK可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5。有文献证明，生长因子，细胞因子和机械刺激通常通过激活MAPK（特别是通过ERK1/2途径）诱导细胞分化和矿化变化。

研究发现miR-135b的潜在靶基因有APC、MEF2C和COL5A1，于是推测表达下调的miR-135b通过它们来调控MAPK和Wnt信号通路，从而促进hDPCs牙源性分化[3]。Chang等[4]指出miR-218通过ERK1/2途径负向调节DPSCs牙本质生成。研究证明，过度表达的miR-143-5p可以通过降低p38 MAPK通路相关基因（MAPK14、Ras和MKK3/6）和成牙本质向分化标志物（ALP、DSPP、OCN）的表达来负向调控这一过程[30];同时，文献[26]报道称，miR-488的下调可通过MAPK1激活p38 MAPK信号通路，同时增加DSPP、ALP和OCN的表达，从而证明miR-488在hDPSCs成牙本质向分化过程中起负向调控作用。另外，也可利用OPG/RANKL信号通路调控Runx2表达来负向调控这一过程[31]。

除以上几种信号通路，此外与DPSCs成牙本质向分化相关的信号通路还有Wnt、TGF-β1/smads、LPS/TLR-4、OPG/RANKL等信号通路[3，21，32-33]。miRNA与这些信号通路及其他相关因子形成复杂网络来调控DPSCs成牙本质向分化。

4 小结与展望

目前，miRNA调控DPSCs成牙本质向分化的具体机制尚不清楚，其中涉及复杂的调控网络。DPSCs成牙本质向分化过程中涉及较多的信号通路，目前有关MAPK途径的报道较多;已发现较多数量的特定miRNA，还有更多miRNA等待发现;它们对牙向分化具有双向作用;现相关研究仅处于分子水平，接下来还需可靠的临床前动物体内实验。因此，人们还需不断研究和探索，为实现牙本质再生及牙再生提供理论基础。

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（收稿日期：2020-12-02） （本文編辑：张爽）