立枯丝核菌诱导下深色有隔内生真菌A024代谢组学分析

宋小双，遇文婧，闵 凯，周 琦，邓 勋，刘艳红，姜瑞凤

（1黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨150040；2黑龙江省森林草原火灾及病虫害防控重点实验室，哈尔滨150040；3大庆油田矿区服务事业部，黑龙江大庆163000）

0 引言

深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes,DSE)是植物根部重要的内生菌类群，具有典型特征，菌丝颜色较深，可形成菌核，与宿主植物互作形成共生体，而不引起植物病变[1-2]。深色有隔内生真菌可与几百种植物形成共生结构[3]，在针叶树中，主要的深色有隔内生真菌种类是子囊菌(Ascomycetes)中的Phialocephala fortiniis.l.—Acephala applanataspecies complex(PAC)类群集合，在针叶树的根系中占据主导地位[4-5]。DSE具有多种促生特性，包括提高植物对土壤养分氮、磷的利用效率[6-8]，DSE对重金属[9-11]、干旱[12-13]具有较强的耐受性，定殖植物根部后，可提高宿主的耐受性，部分菌株具有生防价值，可有效控制土传病害的发生[14-15]。

樟子松(Pinus sylvestrisvar.mongolica)是三北地区主要造林树种，具有生长快、抗逆性强的特点，在生态修复、城市园林绿化等方面发挥了重要的作用[16-17]。立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKühn)可引起针叶苗木立枯病，长期过量的化学农药使用导致病害发生严重、土壤微生态环境破坏[18]。利用土壤益生菌及其代谢产物在有效控制土传病害的同时，可以促进生长，修复土壤微生态环境[19]。深色有隔内生真菌A024(P.bamuru)是从樟子松根部分离得到，对峙培养和发酵液抑菌试验测定结果，其对立枯丝核菌具有较强的抑制作用。代谢组学在植物、微生物、食品和医学等相关领域具有广泛的应用潜力[20-21]，本项目采用LC-MS分析平台研究立枯丝核菌诱导后菌株A024代谢组学，筛选功能化合物和代谢途径，为进一步研究其抑菌作用机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

深色有隔内生真菌A024(P.bamuru)，分离自黑龙江省帽儿山实验林场樟子松根部样品。立枯丝核菌SH(R.solaniKühn)分离自巴彦县林业局苗圃。菌株保存于黑龙江省林业科学院森林微生物实验室。

1.2 菌丝体收集

采用赛璐玢膜覆膜法进行对峙培养[22]。制备90 mm培养皿PDA平板后，覆盖90 mm无菌的赛璐玢膜，无菌打孔器(7 mm)切取深色有隔内生真菌A024(P.bamuru)菌饼接种到距培养皿中心2.5 cm的位置，25℃恒温培养7天后，在菌株A024对向5cm位置接种立枯丝核菌SH(R.solani)菌饼(7 mm)，同时设定不接种立枯丝核菌的A024培养皿作为对照，培养5天后，用灭菌刀片分别刮取A024菌丝，每个1.5 mL离心管100 mg菌丝进行分装，分装完成后液氮速冻，-80℃冰箱保存，其中立枯丝核菌诱导处理样品标为DSE_SH，对照处理样品标为DSE，每处理6个重复。

1.3 菌丝体样品提取方法

取装有菌株A024菌丝体100 mg的1.5 mL离心管，加入20 μL内标（用甲醇配制0.3 mg/mL浓度的L-2-氯苯丙氨酸），用冰浴的甲醇:水(4:1=v:v)总共1 mL，移液枪吸打均匀后，分2次转移到玻璃小瓶中；加入200 μL氯仿，用移液枪吹散；冰浴超声破碎（500 W，6 min，6 s开，4 s关）；将全部的液体转移到离心管中，超声20 min；离心15 min(13000 r/min，4℃)；取提取液1 mL装入1.5 mL离心管中挥发干净；加250 μL甲醇-水(7:3，v/v)溶液，涡旋30 s，超声2 min复溶；4℃低温13000 r/min离心15 min，取处理好的180 μL上清液，装入LC-MS进样小瓶中上机测定。

1.4 LC-MS检测条件

LC-MS分析平台为Waters公司超高效液相色谱串联飞行时间质谱UPLC-Q-TOF/MS系统。色谱条件：色谱柱为 BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 µm；Waters，Milford，USA)；制备2种含0.1%甲酸的流动相，A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序为0～2 min：5%～20%B，2～8 min：20%～60%B，8～12 min：60%～100%B，100%B维持2 min，14～14.5 min：100%到5%B，5%B维持1 min。流速为0.40 mL/min，进样量为3 μL，柱温为45℃。质谱条件：质谱信号采集采用正负离子扫描模式，进样电压和碰撞电压分别为：1.0 kV，40 V和6 eV。离子源温度和去溶剂温度分别为：120℃和500℃，载气流量：900 L/h，质谱扫描范围：50～1000 m/z，扫描时间和间隔时间分别为：0.1 s和0.02 s。

1.5 质谱数据处理

将原始数据导入ProgenesisQI(Waters Corporation，Milford,USA)中，自动进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等，将原始数据转化成包含保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。使用数据库 http://www.hmdb.ca/、http://www.lipidmaps.org/等鉴定代谢物。

1.6 多元统计分析

对于样本质谱峰的响应强度采用峰面积归一化法来进行规格化，得到归一化的数据矩阵，将数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包，用有监督的正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异，寻找组间的差异代谢物。OPLS-DA分析中，变量权重值(Variable important in projection,VIP)大于1的变量被认为是差异变量。为防止模型过拟合，200次置换检验的方法来考察模型的拟合效果。

1.7 深色有隔内生真菌A024代谢物注释分析

通过质谱鉴定的全部代谢物与KEGG和HMDB数据库进行比对，获得数据库注释信息，将代谢物与KEGG Compound数据库比对获得分类信息和KEGG功能通路。

1.8 差异代谢物筛选及代谢通路分析

采用T检验结合OPLS-DA分析方法，筛选立枯丝核菌诱导处理和对照组间差异代谢物（同时满足VIP＞1，p value＜0.05）。通过比对HMDB、KEGG compound和LIPID MAPS数据库，查找差异代谢物的KEGG ID，再进行代谢通路注释和富集(p＜0.05)分析，获得代谢通路图，并分析通路功能。

1.9 数据分析

代谢产物数据分析采用Excel进行，并计算相应的统计学参数，代谢组分析在上海美吉生物云平台上完成。

2 结果与分析

2.1 深色有隔内生真菌A024代谢产物KEGG化合物分类

通过对质谱数据进行分析，A024代谢产物包括9大类，按照数量多少分别是：脂类（114种）、肽类（22类）、核酸（16种）、激素（16种）、类固醇（15种）、维生素和辅酶因子（14种）、有机酸（13种）、碳水化合物（2种）、抗生素（1种）。

表1 菌株A024代谢产物KEGG化合物分类

续表1

2.2 深色有隔内生真菌A024主要代谢通路类别

第一层级代谢通路包括：代谢Metabolism、组织系统Organismal Systems、环境信息过程Environmental Information Processing、人类疾病 Human Diseases、遗传信息过程Genetic Information Processing、细胞过程Cellular Processes、药物开发 Drug Development。检测到的化合物个数分别为318个、90个、63个、45个、13个、23个和6个。

第二层级代谢通路包含代谢物数量从多到少排序，前20位的代谢通路及化合物数量：氨酰tRNA生物合成 Aminoacyl-tRNA biosynthesis（11个）、酪氨酸代谢 Tyrosine metabolism（13个）、血清素突触Serotonergic synapse（13个）、中心碳代谢 Central carbon metabolism in cancer（13个）、萜类和类固醇的生物合成 Biosynthesis of terpenoids and steroids（13个）、色氨酸代谢Tryptophan metabolism（14个）、嘌呤代谢Purine metabolism（14个）、苯丙醇类的生物合成Biosynthesis of phenylpropanoids（15个）、嘧啶代谢Pyrimidine metabolism（16个）、植物激素的生物合成Biosynthesis of plant hormones（16个）、不饱和脂肪酸的生物合成Biosynthesis of unsaturated fatty acids（17个）、莽草酸途径生物碱的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway（17个）、类固醇激素生物合成Steroid hormone biosynthesis（18个）、蛋白质消化吸收Protein digestion and absorption（18个）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢Glycine,serine and threonine metabolism（18个）、花生四烯酸代谢Arachidonic acid metabolism（18个）、神经活性配体-受体相互作用Neuroactive ligand-receptor interaction（20个）、胆汁分泌 Bile secretion（26个）、ABC运输ABC transporters（21个）、植物次生代谢产物的生物合成Biosynthesis of plant secondary metabolites（45个）。

多条次生代谢产物合成途径在菌株A024中检测到，分别是：类黄酮(Flavonoid)、单酰胺菌素(Monobactam)、异喹啉生物碱(Isoquinoline alkaloid)、哌啶和吡啶生物碱(piperidine and pyridine alkaloid)、青霉素与头孢菌素(Penicillin and cephalosporin)、吲哚生物碱(Indole alkaloid)、碳青霉烯(Carbapenem)、新生霉素 (Novobiocin)、葡 萄 孢 菌 素 (Staurosporine)、吩 嗪(Phenazine)、吖啶酮生物碱(Acridone alkaloid)。

2.3 立枯丝核菌诱导与非诱导处理A024样品总离子流比较

通过比较立枯丝核菌诱导与非诱导A024样品的总离子流图，可以看出在早期阶段(3～6 min)检出的小分子、中期阶段(6～8 min)和后期(8～11 min)检出的大分子均存在差异（图1）。

图1 立枯丝核菌诱导与非诱导处理A024样品的总离子流比较

2.4 立枯丝核菌诱导与非诱导处理A024样品的差异分析

采用正交偏最小二乘法判别(OPLS-DA)分析（图2），结果表明，不同处理组DSE_SH组和DSE组明显分开，立枯丝核菌诱导和非诱导的A024代谢组存在差异。

图2 立枯丝核菌诱导(DSE_SH)和非诱导(DSE)的OPLS-DA图

2.5 筛选鉴定A024组间差异代谢物

对处理组DSE-SH和DSE样本进行基于代谢物峰面积的t检验，得到峰面积具有显著差异的代谢物（差异倍数＞1.1倍，且P＜0.05），与KEGG匹配的化合物共52个（表2），同对照相比，诱导后上调的31个，下调的21个。上调的化合物包括：木犀草素3'-(3'-乙酰葡萄糖醛酸)、L-丝氨酸、5-羟基鲍迪木醌、磷酸鸟苷、L-苹果酸、丝氨酸内酯、烟酸等。下调的化合物包括：2E,6Z-金合欢醛、13-酮-9Z,11E,15Z十八碳三烯酸、C16鞘氨醇、地高辛、视黄酯、5,6-环氧-8,11,14-二十碳三烯酸、谷胱甘肽、烟酰胺等。

表2 经立枯丝核菌诱导和非诱导处理A024主要差异代谢物

差异代谢物聚类分析（图3），诱导和非诱导处理不同生物重复之间聚类效果显著，聚集的主要的几类代谢物上调和下调变化规律与处理方式紧密相关。结果表明为应对立枯丝核菌的诱导处理，菌株A024的次生代谢产物同对照相比，发生显著变化。

图3 差异代谢产物聚类分析Heatmap

2.6 组间差异代谢物KEGG通路富集分析

富集程度前20的差异代谢物代谢途径包括：逆行内源性大麻素信号Retrograde endocannabinoid signaling、花生四烯酸代谢Arachidonic acid metabolism、组氨酸和嘌呤类生物碱的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from histidine and purine、植物次生代谢产物的生物合成Biosynthesis of plant secondary metabolites。此外萜类和聚酮类生物碱的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from terpenoid and polyketide、鸟氨酸、赖氨酸和烟酸生物碱的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine,lysine and nicotinic acid、萜类和类固醇的生物合成Biosynthesis of terpenoids and steroids、苯丙醇类的生物合成Biosynthesis of phenylpropanoids、植物激素的生物合成Biosynthesis of plant hormones、莽草酸途径生物碱的生物合成Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway（图 4）。

图4 富集程度前20的差异代谢物代谢途径

3 讨论与结论

目前关于深色有隔内生真菌的其生物防治作用，主要集中在高效菌株分离筛选，生物防治潜力等方面，Narisawa利用诱饵植物分离筛选出两株生防菌P.fortiniiC.J.K.Wang&H.E.Wilcox和Heteroconium chaetospira(Grove)M.B.Ellis，可有效控制大白菜病害，包括由Plasmodiophora brassicaeWoronin引起的根肿病和轮枝孢属真菌Verticilliumspp.引起的轮枝孢黄萎病[23-25]。Christoph T从P.europaea的代谢产物中分离得到4种主要成分，核盘菌素sclerin，菌核内酯sclerolide，菌核素A sclerotinin A和菌核素B sclerotinin B，可显著抑制疫霉菌Phytophthora citricola的生长[26]。TellenbachE研究发现P.sphareoides可以通过产生多样的生物活性物质可以有效抑制Heterobasidion parviporum对挪威云杉的侵染[27]。Ivo[28]利用生态位的竞争作用，通过接种低毒性的PAC菌株可有效控制高毒性PAC菌株对植物的危害，对代谢组的研究较少。本研究重点聚焦深色有隔内生真菌的代谢组分析，采用LC-MS分析平台，研究立枯丝核菌诱导条件下的深色有隔内生真菌A024非靶向代谢组，结果表明A024代谢产物包括9大类，27小类，此外A024还检测到包括类黄酮、单酰胺菌素、喹啉生物碱、青霉素与头孢菌素、新生霉素、吩嗪等多条次生代谢产物合成途径。通过DSE_SH、DSE组样本t检验，得到峰面积具有显著差异的代谢物，与KEGG匹配的化合物共52个，同对照相比，诱导后上调的31个，下调的21个。其中包括部分黄酮类化合物以及L-苹果酸、磷酸鸟苷、烟酸等显著上调。差异代谢物聚类分析，诱导和对照处理差异代谢物的上调和下调变化与不同处理紧密相关，立枯丝核菌处理对菌株A024的次生代谢产物产生了影响。差异代谢产物的KEGG富集分析中花生四烯酸代谢、组氨酸和嘌呤类生物碱的生物合成、植物次生代谢产物的生物合成、萜类和聚酮类生物碱的生物合成，但是差异代谢物和KEGG富集的代谢通路具体的作用机制，还需要进一步的研究。综上，本研究利用LC-MS平台对立枯丝核菌诱导条件下深色有隔内生真菌A024的非靶向代谢组进行分析，筛选得到多个差异显著性代谢产物及其富集的代谢通路，为进一步研究其对立枯丝核菌的抑制作用机制打下基础。