新一代分子诊断技术在输入性传染病快速检测中的应用*

赵扬阳，许 颖，常晓松

1.成都医学院(成都 610500)；2.成都医学院第一附属医院 检验科(成都 610500)；3.四川国际旅行卫生保健中心成都海关口岸 门诊部(成都 610042)

近年来国际传染病形势严峻，严重威胁着全球经济和人类健康。输入性传染病病原体检测作为卫生检疫防控工作中的重要一环，对于减轻传染病风险至关重要。目前，病原体鉴定的金标准是病原体的分离培养，常用的检查技术是免疫学诊断和分子诊断。传统的检测技术各有利弊，尚无法满足当下对更快速、准确、灵敏检测病原体技术的需要。随着高新技术的发展和医学科学的进步，新一代分子诊断技术成为快速检测输入性传染病病原体的新趋势。本综述结合相关文献，总结新一代分子诊断技术在即时诊断输入性传染病方面的应用，阐述其作为传染病诊断技术的应用前景，为输入性传染病快速检验提供新的策略。

1 输入性传染病

1.1 我国主要输入性传染病

随着经济全球化的推进，各国人员频繁往来和国际间密切的贸易合作，使来自世界各地的传染病可以输入到中国。我国目前主要的输入性传染病包括呼吸道传染病、虫媒传染病、消化道传染病等[1]。

其中，输入性呼吸道传染病由于呼吸道与外界相通易受病原体侵袭，人群易受感染，是我国口岸确诊第一位的输入性传染病[1]。输入性呼吸道传染病病原体主要包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒等。2020年新型冠状病毒肺炎疫情爆发使其成为全球重点关注的呼吸道传染病，目前我国新冠病毒肺炎病例以输入性为主。输入性虫媒传染病是由病媒生物传播的自然疫源性疾病，常见的病原体如黄热病毒、登革热病毒、寨卡病毒、疟原虫、基孔肯雅病毒等，都会引起危害性较强的传染病[2]。输入性消化道传染病是由感染者或携带者排泄物中的病原体直接或间接污染手、水或食品食具，经口进入体内而引起消化道感染，主要包括霍乱、肠出血性大肠杆菌感染、手足口病等[1]。

1.2 病原体的常规检测技术

在面临重大输入性传染病时，及时性和准确率是国境口岸病原体检测最重要的考虑因素。目前，输入性传染病病原常规检测方法主要采用分子诊断、免疫学诊断、病原体分离培养等。其中，病原体分离培养方法是病原体确诊经典的方法，但该方法操作复杂、耗时长，难以满足快速检测的需求[3]。免疫学诊断技术常用胶体金、酶联免疫吸附实验和化学发光等技术，具有成本低、操作简便、检测速度快等优势，但主要存在抗体阳性不能代表现症感染、灵敏度低、对窗口期有要求等问题[4]。分子诊断技术是用分子生物学方法通过检测各种病原体遗传物质的表达和结构，进而实现对疾病的预测和诊断[5]。其中荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)是近年来发展较为迅速的分子诊断技术，在传染病诊治中起到了重要作用，现已成为实验室检测的金标准[6]，具有准确、灵敏的特点，但成本高、操作复杂、对实验平台和人员要求高，导致大范围应用难度大。目前常规的检测技术在操作步骤、设备需求、准确性和检测周期等方面仍存在各自的缺陷，这使得这些方法难以在疫情现场、口岸等场景下快速准确鉴定输入性传染病种类。

近年来，经过飞速发展，新一代分子诊断技术具备了特异性高、灵敏性强、快速检测等特点，并不断突破现有检测技术对人员、场所的限制，简化操作步骤、提升检测通量，能满足在疫情现场、口岸等更多场景对输入性传染病病原体快速精准诊断的需求。

2 新一代分子诊断技术

为有效提高输入性传染病的检测效率和防疫能力，快速诊断技术一直是输入性传染病病原体检测方面研究的热点。目前应用于快速诊断的分子诊断技术主要包括微流控芯片技术、恒温扩增技术、成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,CRISPR)技术、纳米孔测序技术等。

2.1 微流控芯片技术

微流控芯片是将生命科学应用分析的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集合到一块芯片上的微型化整合技术，加入少量的样本体积即可实现短时间内数个样品的平行自动分析[7]。微流控芯片具有快速准确、操作简便、多功能集成、高通量的特点，在输入性传染病检测中获得了大量的研究，以微流控芯片为基础建立快速精准便捷的诊断技术，可实现即时诊断[8]。随着微流控芯片技术的不断发展，目前已经诞生了纸基微流控芯片、数字微流控芯片、电泳分析微流控芯片、POC微流控芯片等多种微流控芯片[9-11]。

微流控芯片技术作为交叉学科用于检测输入性传染病，对病原体检测技术的发展有着突破性意义。目前微流控芯片在输入性传染病快速检测领域的研发主要与其他各类技术结合，如与 PCR技术、恒温扩增技术等，应用于检测多种输入性虫媒传染病病原体[12-14]以及输入性消化道[15]、呼吸道传染病病原体的多重检测[16-17]。在多种类型的微流控芯片中，纸微流控芯片具有低成本、易携带和一次性使用的优点[18]，在病原体快速检验的领域获得了越来越广泛的关注。Teengam等[19]研发了一种纳米颗粒聚集的比色纸基微流控系统可用于特异性检测中东呼吸综合征冠状病毒DNA，检测限值为1.53 nM。Kaarj等[20]开发出一种基于逆转录环介导恒温扩增技术(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)的纸质微流控芯片检测寨卡病毒，经过68 ℃、30 min的放大反应后比色法检测，结果通过智能手机成像进行量化，检测限低至1个拷贝/μL，同时还可用于识别基孔肯雅病毒、登革热病毒等其他传染性病原体的快速鉴定。

微流控芯片相比传统分子诊断技术对输入性传染病的诊断，在各方面都有突破性的飞跃和创新。其主要特点是微型化、集成化和自动化，还可避免因传统检测方法功能的局限而带来的损失与污染，缩短了检测时间，降低了操作门槛；同时微流控芯片属于DNA芯片，其发展拓宽了生物芯片的适用范围，成为输入性传染病体外诊断未来发展依托的主要检测平台之一。

2.2 恒温扩增技术

恒温扩增是一种建立于PCR基础上开发的核酸扩增手段。通过加入一些特殊设计的蛋白酶和引物，一个温度即可完成扩增，无需反复升降温。从20世纪90年代恒温扩增技术被提出后，迄今为止全世界共有10多种常见的恒温扩增技术，包括环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶介导链替换核酸扩增技术(recombinase-aid amplification,RAA)、转录介导扩增技术(transcription mediated amplification,TMA)、酶促重组等温扩增法(enzymatic recombinase amplification,ERA)等，其原理也不尽相同。

2.2.1 LAMP LAMP是根据序列保守区域设计引物特异性识别目标序列上的6个相应区域，在Bst聚合酶的作用下60 ℃～65 ℃恒温内，60 min内大量扩增目标DNA片段，同时伴随副产物白色焦磷酸镁沉淀的产生[21]。LAMP具有灵敏、稳定、快速且特异的优点，已经实现对细菌、病毒和寄生虫等病原微生物的快速检测，应用于输入性传染病的诊断[22]。目前LAMP已经发展为普通LAMP、RT-LAMP、实时浊度定量LAMP等。

LAMP在病毒快速检测领域发展迅速[23]，可对基孔肯亚病毒、登革病毒、SARS病毒和中东呼吸综合征冠状病毒等[24-27]多种输入性病毒进行准确鉴定，是一种前景广阔的快速诊断技术。近年来，基于LAMP的检测技术向可视化发展，更利于现场快速诊断输入性传染病。Huang等[28]建立了一种结合RT-LAMP和垂直流动显示条的可视化技术检测中东呼吸综合征冠状病毒 N基因，可检测10拷贝/μL的RNA，35 min内快速完成检测。此外，Xu等[29]开发了一种基于纸折纸的全血诊断疟疾的可视化方法，试验可在50 min内完成，可检测出98%的疟疾感染者，使患者的全血样本中检测疟疾成为可能。

2.2.2 RAA RAA是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在39 ℃恒温条件下完成扩增的技术[30]，具有反应快速、操作简单等特点，RAA和进一步发展的逆转录重组酶介导检测方法(reverse transcription-recombinase-aid amplification, RT-RAA)目前已应用于输入性传染病的检测。陈淑丹等[31]利用RAA技术建立了快速检测呼吸道腺病毒的方法，用不同拷贝数hexon基因片段的重组质粒进行RAA扩增，在20 min内即可得到扩增结果，最低检测限为10拷贝/μL，特异性高。此外，Yan等[32]通过RT-RAA检测柯萨奇病毒A6 和柯萨奇病毒A10，30 min内完成扩增，成本低且分析灵敏度远高于商业RT-PCR[32]。

相比于常用的PCR技术，恒温扩增技术只需要一个温度即可完成扩增反应，缩短了核酸扩增的时间，并具备灵敏特异、操作简便、不需昂贵仪器的优势，能够实现实时检测。随着分子诊断技术的不断进步，恒温扩增技术与微流控芯片技术的结合使用将使各个反应模块实现封闭化，解决交叉污染的问题，全自动化、全集成的检验操作正逐步实现，使得操作流程更加简易。

2.3 CRISPR技术

CRISPR及其相关基因(CRISPR associated gene,CRISPR/Cas)系统能在向导RNA指引下，通过一种CRISPR相关酶(Cas)裂解目标DNA或RNA[33]。CRISPR系统具有稳定、快速、准确、灵敏的特点，可作为检测病原体的核酸和生物标志物超灵敏方法，目前已用于开发输入性传染病的快速分子诊断试剂盒。常用于分子诊断的Cas酶包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14，这些酶具有高特异性和附带活性，目前在基于不同Cas酶的CRISPR检测平台中最具代表性的是SHERLOCK和DETECR[34]。

2.3.1 SHERLOCK SHERLOCK平台由张峰研究组开发基于Cas13的核酸检测。在RNA底物逆转录之后，恒温扩增后的模板在体外使用T7转录，产生的模板被Cas13-向导RNA复合物识别并切割，Cas13辅助活性会使荧光标记物降解，随后通过检测荧光而指示目标的存在[35]。SHERLOCK适用于RNA病毒的快速检测，许多常见或致命的输入性传染病病原体都是RNA病毒，SHERLOCK已应用于快速灵敏检测患者样本中的寨卡病毒、登革热病毒和黄热病毒等[35-36]。2020年Joung等[37]报道了基于SHERLOCK的新冠病毒检测技术STOPCovid.V2的流程，检验结果能够达到93.1%的灵敏度和98.5%的特异性，阳性样本只需15～45 min就能获得结果。

2.3.2 DETECR DETECR是由Jennifer团队开发的检测平台，其工作原理与SHERLOCK相似，不同之处在于使用Cas12a通过向导RNA靶向特定的DNA序列，将单链DNA-荧光淬灭基团加入反应中，在单链DNA降解时产生信号，适用于任何基于DNA检测的快速诊断[38]，在对新冠病毒检测的应用研究[39]显示，基于DETECR平台整个病毒检测过程可在1 h内完成。

CRISPR/Cas检测平台具有快速、灵敏特异、易构建、便携性等特点。CRISPR/Cas系统与恒温扩增、免疫层析等其他技术相结合可建立更加便捷的快速诊断方法，在输入性传染病病原体快速检测中有着开阔的发展前景。

2.4 纳米孔测序技术

第三代测序技术是以单分子测序及纳米孔测序为代表，其中纳米孔测序技术是基于电信号的测序技术，通过电流信号的特征性改变，来确定正在通过该孔的DNA或RNA的碱基序列。纳米孔测序能够边解链边测序，具有便携化、长片段读长、小型化、易集成、时效性强等优势，目前在输入性传染病病原体检测应用中已有大量研究，纳米孔测序技术也被公认为是未来测序发展的一大方向[40]。

目前已经商业化推广的纳米孔测序方案不多，2014年第一个商品化的便携式纳米孔测序仪MinION发布，标志着纳米孔测序正式进入基因测序技术[41]。MinION作为第三代测序的代表平台之一，凭借快速测速和方便携带，能够实时分析DNA或RNA序列，在传染病、临床微生物和宏基因组学等研究中具有广阔前景[42-44]。Hoenen等[45]通过评估在西非埃博拉病毒爆发条件下MinION的可行性，证明其作为快速检测工具的潜力。新冠疫情爆发后，武汉大学团队研发的纳米孔靶向测序技术，通过检测出不同病毒的序列，实现了4 h内同时准确检测新冠病毒及其他十大类呼吸道病毒，还可同时对检测病毒突变情况进行分型[46]。

纳米孔测序技术的优势使现场基因测序成为可能。其能够提供动态、实时的测序，支持在短时间内同时获得不同病原体鉴定及分型，其快速采样到出结果周转时间短，未来在输入性传染病、实地动态监测疫情暴发以及其他诊断方面都具有巨大潜力。

3 应用前景与局限

快速鉴定病原体是有效实施输入性传染病防控策略的关键。当前输入性传染病快速诊断的主要困扰包括灵敏度、成本以及设备和熟练技术人员的需求。传统的分子诊断要求具备生物安全二级及以上实验室条件及相应的个人防护，对应用场景有较高要求，限制了应用推广。同时传统分子诊断技术的样本周转时间较长，在输入性传染病集中爆发期有较大局限性。而新一代分子诊断技术可克服上述缺陷，结合纳米孔测序技术、微流控技术和设备制造等多学科交叉技术，为快速精准诊断平台的成功开辟了新的前景。在拥有准确性的前提下，可突破实验室条件限制，凸显便捷、高效、低培训成本、可同时排查多种输入性传染病的优势，使其能应用于疫情现场、口岸等场景下对输入性传染病的快速检验。目前输入性传染病快速分子诊断技术尚在不断改进中，但依然存在尚未满足经济实惠的要求、检验质量控制缺乏规范和标准、临床管理不够完善等实际问题，需要进一步研发与应用评价。

4 展望

新一代分子诊断技术的应用，对输入性传染病快速诊断、临床实验室的应用乃至社会传染病的高效防控等带来重大机遇。随着科学技术的进步及多学科的融合交叉，更多先进的快速检验技术将进入输入性传染病检测的应用阶段。但同时需要意识到，分子诊断技术对病原体的检测在质量控制和临床管理方面仍存在诸多挑战，未来需要建立更多的应用科学研究、卫生经济学评价及相适应的质量体系等，支撑分子诊断在输入性传染病领域的持续性创新发展。