抗衰老和抗纤维化的嵌合抗原受体T细胞

李飞 陆伦根

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)最早于1989年由Zelig Eshhar提出，他将抗体的轻重链与T细胞受体(TCR)的恒定区相连，构建出不依赖主要组织相容性复合物(MHC)的嵌合T细胞受体[1]。基于该原理，他提出具有肿瘤特异性嵌合抗原受体(CAR)的T细胞可用于杀灭肿瘤细胞的设想。经过多年发展，CAR-T技术日臻成熟，且被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗血液系统恶性肿瘤并取得了极佳的疗效[2]，同时有大量研究在探索该疗法用于治疗实体瘤的可能性[3- 4]。该方法首先需从患者外周血中分离出T细胞，采用基因工程技术进行修饰，使其能够表达肿瘤特异性嵌合抗原受体，并在体外大量扩增后再回输至患者体内，肿瘤特异性抗原受体可以特异性识别肿瘤细胞膜表面抗原并激活T细胞对肿瘤细胞实施免疫清除[5]。除此之外，CAR-T细胞还被尝试用于抗衰老和抗纤维化治疗等方面[6]。

细胞衰老又称为复制性衰老，是指细胞不可逆地丧失增殖能力，进入细胞周期停滞状态。衰老细胞可以分泌炎症因子、趋化因子、肿瘤坏死因子、蛋白酶等衰老相关分泌表型(SASP)，这些分子能招募NK细胞和T细胞对衰老细胞进行免疫清除，参与组织重建、创伤愈合、免疫监视等生物学功能，而衰老细胞的聚集可能导致疾病，因此清除衰老细胞有可能用于疾病治疗[7]。肝星状细胞(HSC)在肝脏受损后活化并分泌细胞外基质(ECM),在肝纤维化和肝硬化的形成中发挥核心作用[8]。活化的星状细胞具有极大的异质性和各自不同的生物学特点。根据其增殖能力和分泌ECM的能力，可将HSC分为具有高增殖能力的HSC、具有较强ECM分泌能力的HSC以及衰老的HSC等三个亚群[9]。研究表明，抑制HSC或清除HSC可减少其通过自分泌、旁分泌对自身和其他细胞的作用，进而抑制肝纤维化的发生和进展[8]。

Amor等[10]研究发现，通过CAR-T可以靶向杀灭衰老的星状细胞，减轻肝纤维化，改善肝功能。在该实验中，研究人员通过RNA测序分析MEK联合CDK4/6抑制剂诱导的衰老肺腺癌细胞、N-ras原癌基因诱导的衰老肝细胞以及体外增殖诱导的衰老小鼠肝星状细胞的转录组，最终筛选出衰老细胞高表达、其他重要组织器官不表达的PLAUR作为衰老特异性基因，该基因编码尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)，该受体表达于细胞膜表面，参与组织重建、伤口愈合以及肿瘤形成等病理生理过程，在与配体结合后酶解为可溶性uPAR(suPAR)作为SASP和衰老相关疾病的血清学标志物[11]。免疫组织化学实验证实，该受体表达于多种衰老细胞膜表面，包括非小细胞肺癌、胰腺癌以及四氯化碳所致肝纤维化小鼠模型肝脏细胞。此外，该课题组还证实，不同病因所致人肝纤维化组织高表达uPAR，这些uPAR阳性细胞高表达SA-β半乳糖苷酶、p16以及IL-6等衰老相关分子，低表达细胞增殖标志物Ki67；进一步研究表明，部分uPAR阳性细胞共表达星状细胞标志物desmin。基于以上实验结果，uPAR被认为是一个具有较高特异性的衰老相关细胞膜蛋白。因此该课题组构建了uPAR特异性小鼠CAR-T细胞，并将其分别注射至四氯化碳或高脂饮食所致肝纤维化小鼠体内，20 d后获取肝组织样本，发现给予uPAR特异性CAR-T细胞小鼠肝脏衰老细胞显著减少，并且肝纤维化程度明显改善。因此，CAR-T细胞有望成为治疗肝纤维化的新方法。

尽管Amor课题组发现uPAR特异性CAR-T细胞能减轻肝纤维化，并改善肝功能，但该治疗方案仍有诸多问题需要解决。既往研究表明，衰老的星状细胞分泌ECM的能力下降，并能分泌ECM降解相关酶；另外衰老的星状细胞可招募多种免疫细胞，尤其是NK细胞对其进行免疫清除并能降解ECM的沉积，因此衰老的星状细胞能通过多种机制抑制肝纤维的进展[9,12]。在Amor的研究中，CAR-T细胞清除掉uPAR阳性的衰老星状细胞，并没有将具有活跃增殖能力和分泌ECM的活化的星状细胞杀灭，却展现出显著的抗纤维化效果，因此uPAR特异性CAR-T细胞减轻肝纤维化的机制有待进一步研究。uPAR并非衰老的星状细胞特异性标志物，且活化的星状细胞亦不同程度表达uPAR，衰老的星状细胞与活化的星状细胞存在一定程度重叠，而非完全独立的两个亚群。此外，Amor等发现uPAR阳性的星状细胞表达SA-β半乳糖苷酶和p16等衰老标志物，但并非所有uPAR阳性的星状细胞均表达衰老标志物，表明并非所有uPAR阳性的星状细胞都处于衰老状态。另外，部分uPAR阳性细胞表达巨噬细胞标志物F4/80，表明uPAR特异性CAR-T细胞亦可杀灭巨噬细胞，因此uPAR特异性CAR-T细胞治疗肝纤维化的机制有待进一步明确。本研究仅对四氯化碳和脂肪肝所致肝纤维化小鼠模型进行描述，未对其他病因所致人肝纤维化组织uPAR的表达情况进行探索，因此需要进一步研究。在本实验中，Amor等仅实施了单次CAR-T细胞注射治疗，20 d后即获取小鼠肝脏和血清样本进行分析，因此无法评估其长期疗效和不良反应。另外，其他组织细胞也可低表达uPAR，而作为uPAR特异性CAR-T细胞的靶标，CAR-T细胞对这些细胞的清除是否会产生严重不良反应亦有待进一步研究。

综上所述，衰老的星状细胞表达膜蛋白uPAR，据此可构建uPAR特异性CAR-T细胞对其进行免疫清除治疗肝纤维化和改善肝功能。但该治疗方案能否用于肝纤维化治疗尚需完成以下工作：明确uPAR在星状细胞、巨噬细胞中的表达情况，阐明uPAR特异性CAR-T细胞缓解肝纤维化的确切机制；明确uPAR在不同病因所致人肝纤维化中的表达情况，以此判断uPAR特异性CAR-T细胞是否能广泛用于各种病因所致肝纤维化的治疗；全面评估uPAR特异性CAR-T细胞治疗肝纤维化的长期疗效以及不良反应。