油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

皇甫海燕，史志丹，郝丽芬，燕孟娇，宋培玲，杨永青，贾晓清，皇甫九茹，郭 晨，李子钦

(内蒙古自治区农牧业科学院 植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031)

油菜黑胫病(Blackleg)，是由黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa)病原真菌引起的一种真菌病害[1]，可危害油菜的叶片、茎秆、角果等组织[2]，导致我国油菜产量损失、品质下降[3-4]。目前，我国已经开展了油菜Leptosphaeriabiglobosa的生物学特性[5-6]、侵染条件和途径[7]、遗传多样性[8]、致病力分化[9]等方面的研究，但还未见关于黑胫病菌致病机制研究的报道。

T-DNA插入目的基因的突变体技术是将T-DNA片段随机插入病原菌基因组引起某段基因突变，从而造成该基因功能缺失，进而通过表型变化来解析目的基因功能的方法[10]。根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)是应用最为广泛的T-DNA突变体技术，该方法具有插入拷贝数少、转化效率高[11]、操作简便并易得到稳定转化子等特点[12]。利用该方法构建突变体库，从中筛选获得致病力减弱的突变体，通过对病原菌的表型鉴定和分析插入位点的侧翼序列，确定发生突变的基因，分离和研究病原菌致病相关基因及其功能[13]。目前T-DNA 插入位点侧翼序列的扩增多采用半随机引物PCR法，主要包括：热不对称交错PCR法(TAIL-PCR)、高效热不对称交错PCR(Hi TAIL-PCR)、限制位点PCR(Restriction-site PCR，RSPCR)、单寡核苷酸巢式PCR(Single oligonucleotidenested PCR，SON-PCR)，其中前2种方法应用较多[14]。因此，本研究从T-DNA插入Leptosphaeriabiglobosa突变体库中，筛选致病力减弱的突变体，并对其表型特征进行观察，随后利用Hi TAIL-PCR扩增其侧翼序列，通过GenBank上Blast比对序列，初步确定了致病力减弱突变体的T-DNA插入位点侧翼序列，为进一步筛选Leptosphaeriabiglobosa致病基因提供研究基础，并为其致病机制的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料、菌株及质粒 供试甘蓝型油菜品种为青杂5号；野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1由内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所保存。Leptosphaeriabiglobosanm-1T-DNA突变体库由双元载体pCH-sGFP-GUS作为转化供体所得，其中pCH-sGFP质粒由内蒙古农业大学赵君教授惠赠。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶PstⅠ，DNA琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒，CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒，购自TaKaRa宝生物工程大连有限公司；地高辛杂交检测试剂盒Ⅱ(化学发光法)，PCR DIG Probe Synthesis Kit，购自Roche公司；HyBond N+正电荷尼龙膜，购自Amersham公司；引物合成及测序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 致病力减弱突变体的筛选 基于前期试验，构建获得T-DNA突变体库[15-16]，从中随机挑取16株单孢分离后的突变体菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1为对照，接种于PDA平板上，25 ℃培养12～15 d，刮取分生孢子，制备孢子悬浮液，将浓度调至0.2×106个/mL后备用。采用穿刺接种法[17]对突变体的致病性进行鉴定，具体是将10 μL的孢子悬浮液接种于油菜子叶上，每个突变体最少接种10片子叶，12 d后调查油菜的发病情况及病情指数，筛选出致病力减弱突变体，重复3次。

1.2.2 致病力减弱突变体菌落形态及生长速率测定 调查不同突变体菌株的致病力，挑选出致病力下降程度大的突变体菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1作为对照，将菌饼(Φ=3.5mm)转接在PDA上，25 ℃培养7 d后，观察其菌落形态，并拍照记录，同时测量菌落直径，计算菌丝生长速率(cm/d)，重复3次。

1.2.3 致病力减弱突变体菌株产孢量的测定 将以上挑选的致病力减弱突变体，以Leptosphaeriabiglobosanm-1作为对照，PDA上25 ℃培养14 d后，获得分生孢子悬浮液后，利用血球计数板计数，计算其产孢量，重复3次。

1.2.4 致病力减弱突变菌株的Southern Blot检测 CTAB法提取致病力减弱突变体和Leptosphaeriabiglobosanm-1基因组DNA，用限制性内切酶PstⅠ酶切，电泳后转到尼龙膜上，采用紫外交联仪将核酸固定。再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，杂交完成后进行洗膜及信号检测。

1.2.5 T-DNA插入侧翼序列的克隆、测序和分析 利用高效热不对称交错PCR(Hi TAIL-PCR)扩增T-DNA插入侧翼序列，简并引物为LAD1～LAD5；特异性嵌套引物为RB1～RB3(表1)，与通用简并引物LAD和接头序列AC组合，以野生型菌株和致病力减弱突变体菌株基因组DNA 为模板进行3 轮Hi TAIL-PCR 反应。PCR反应程序参照文献[18]，将第3轮PCR产物经凝胶回收、TA 克隆，挑取阳性转化子进行测序，测序结果在NCBI数据库中Blast查询比对。

表1 Hi TAIL-PCR扩增侧翼序列引物Tab.1 Primers for amplifying flanking sequence by Hi TAIL-PCR

2 结果与分析

2.1 致病力减弱突变菌株的获得

测定16株突变体菌株的致病力(图1)，野生型菌株Leptosphaeriabiglobosanm-1作为对照，其中3株突变体菌株的相对病情指数显著高于对照(P>0.05)，分别是T17、T18、T21。12株突变体菌株的相对病情指数比对照小，分别为T1、T3、T4、T5、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14。其中野生型菌株nm-1病情指数为48.6，突变体T1的病情指数为35.5，T3为32.5，T4为31.3，T5为41.3，T7为35.3，T8为42.3，T9为31.0，T10为42.5，T11为25.4，T12为46.3，T13为44.6，T14为37.8，分别降低了27.0%，33.2%，35.8%，15.0%，27.4%，36.2%，13.0%，36.2%，12.6%，47.7%，8.2%，22.2%。与野生型菌株nm-1相比，T1、T3、T4、T5、T7、T9、T11、T14这8株突变体菌株的致病力显著降低(P<0.05)，为致病力减弱菌株。

2.2 致病力减弱突变体的菌落形态特征

通过上述试验，最后筛选出6个致病力减弱突变体(T1、T3、T4、T7、T9、T11、T14)，培养7 d后，对这些突变体的菌落形态进行观察，结果发现，突变体T1、T3、T4、T7与野生型菌株nm-1菌落形态相比基本没有差异，而突变体T9、T11菌丝形态致密，紧致，没有产生孢子，与野生型菌株nm-1相比，具有较大差异(图2)。

2.3 致病力减弱突变体的生长速率

培养7 d后，对致病力减弱的6个致病力减弱突变体的生长速率进行测定(图3)，结果发现，6个致病力减弱突变体T1、T3、T4、T7、T9的生长速率较快，分别为0.68，0.69，0.68，0.60，0.67 cm/d。与野生型菌株nm-1(0.59 cm/d)相比，差异不显著(P>0.05)，只有突变体T11生长速率为0.32 cm/d，与野生型菌株nm-1相比显著下降(P<0.05)，下降了23.7%。

2.4 致病力减弱突变体的产孢量

培养14 d后，测定6株致病力减弱突变体的产孢量(图4)，T1、T3、T4、T7、T9、T11的产孢量分别为0.46×106，0.50×106，1.38×106，1.24×106，0.40×106，0.51×106个/mL，与野生型菌株nm-1的产孢量(3.84×106个/mL)相比，都显著下降(P<0.05)，分别下降了87.9%，87.0%，64.1%，67.8%，89.6%，86.7%。

2.5 致病力减弱突变体Southern Blot 检测

利用Southern Blot检测突变体菌株(图5)，6个突变体的基因组经过限制性内切酶PstⅠ酶切，与DIG标记探针杂交，均只有1个杂交信号，说明T-DNA以单拷贝形式插入到各突变体的基因组中。

2.6 致病力减弱突变体侧翼序列分析

利用Hi TAIL-PCR技术对6株致病力减弱突变体插入位点的右翼序列进行PCR扩增，在第3轮PCR结束之后，得到了清晰的特异性条带，大小在200～1 000 bp(图6)，经回收、测序后，在GenBank上Blast比对分析，与Leptosphaeriabiglobosa的基因组scaffold 同源性达95.0%以上，获得了T-DNA 具体的插入位置(表2)，可以看出，T-DNA的插入位点与scaffold 的长度和位置没有联系，说明T-DNA 在基因组上的插入是随机的。

表2 T-DNA 插入位点序列分析Tab.2 Sequence analysis of T-DNA insertion site

3 讨论与结论

目前，我国对于油菜黑胫病的防治，主要通过化学药剂进行防治，还没有黑胫病抗性品种。因此，筛选L.biglobosa致病基因及进一步研究L.biglobosa的致病机制，有助于认识和防治油菜黑胫病的发生，并为油菜抗黑胫病育种提供一定的理论基础。目前，国内尚未见有关L.biglobosa致病机制的研究报道，而获得大量的突变体、鉴定突变体的表型特征、进行致病力及插入位点侧翼序列的分析是病原菌致病机理研究的最佳方式。利用农杆菌介导的T-DNA插入目的DNA，是筛选突变体的关键技术[19]，对插入位点侧翼序列的扩增分析，是致病基因克隆及基因功能研究的基础[20]。本研究从已建立的L.biglobosa突变体库中筛选致病力减弱的突变体，并对致病力显著下降的突变体进行菌落形态观察、生长速率和产孢量进行测定，发现这些突变体的菌落、菌丝形态、生长速率和分生孢子产孢能力出现变化，说明T-DNA插入在一定程度影响着L.biglobosa的生长发育，有可能影响了它的营养运输，这也可能与致病力的减弱有关，也说明T-DNA 的插入破坏了L.biglobosa致病相关基因的表达。这些突变体将为研究L.biglobosa致病相关基因克隆提供候选条件。

另外，本研究应用Hi TAIL-PCR技术，经过3轮PCR，克隆了6个致病力减弱的右侧翼序列，6个侧翼序列比对到L.biglobosabrassicae的scaffold基因组，这6条序列与L.biglobosabrassicae菌株基因组同源性均在95.0%以上。因为虽然有L.biglobosabrassicae菌株的全基因组测序序列，但由于基因组未进行注释，比对结果只能获得T-DNA 插入位点。下一步工作将采用RACE-PCR，根据侧翼基因片段，克隆L.biglobosa致病力减弱侧翼基因全长，然后通过基因敲除突变体对其功能及致病机理作进一步研究。本研究初步明确了T-DNA 插入油菜黑胫病菌L.biglobosa位置。为下一步致病基因的克隆和功能研究奠定了基础，也为致病机理的研究提供参考。