cfDNA 含量测定在妊娠期肝内胆汁淤积症中的应用

凌寅杰，陈冬婵，鲍婷婷，潘皆慰，袁琛

妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是一种妊娠期内较为常见的并发症，极易导致早产、宫内窘迫，增加围产儿的死亡率，同时对孕妇的健康造成一定的损害[1]。近年来研究表明，患有ICP 的孕妇外周血及其新生儿脐血胆汁酸水平明显升高，胆汁酸的毒性作用会影响胎儿心脏功能[2]，还会导致胎儿胰腺内分泌功能的异常。外周血游离DNA（cfDNA）的相关检测在产前诊断和肿瘤研究中已经取得了很多研究进展[3]，而对于cfDNA和ICP及新生儿血清总胆酸（TBA）、胆汁酸（CA）之间的关系的研究尚未有报道。本研究探讨cfDNA 含量与ICP 的关系，同时对于孕妇外周血cfDNA 含量与新生儿TBA、CA 浓度的相关性进行分析，为临床诊断及预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014 年7 月至2019 年6 月浙江省湖州市妇幼保健院收治的妊娠期胆汁淤积症（ICP）377 例为研究组，另选取同期正常孕妇105 例作为对照。研究组均符合《妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南（2015）》[4]中的相关标准，年龄20 ～42 岁，平均（28.8±1.3）岁；孕周30 ～40 周；其中初产妇204例，经产妇173 例。对照组年龄19 ～39 岁，平均（27.5±1.5）岁；孕周31 ～41 周；其中初产妇61 例，经产妇44 例。两组一般资料差异均无统计学意义（＞0.05），入选孕妇及家属均签署了知情同意书，本研究经湖州市第一人民医院及湖州市妇保院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 TBA、CA水平检测 孕妇临产后于清晨空腹采静脉血1ml，胎儿娩出后采脐动脉血1ml。及时离心分离血清（2500 r/min，5min），利用HXD02 贝克曼A全自动生化分析仪测定血清TBA和CA水平。

1.2.2 cfDNA浓度及完整性检测 孕妇临产后抽取肘静脉血1 ml，胎儿娩出后采脐动脉血1 ml，将所采外周静脉血置于EDTA 管中，离心（2 500 r/min，5 min）后取血清，利用FirePure Circulating Free DNA Mini Kit 试剂盒（苏州）提取cfDNA，每个标本最终洗脱体积为50 l。提取的DNA 经NanoDrop ND-1000 核酸定量仪测定吸光度（A260/A280），取比值为1.6 ～1.8 的样本并对各样本浓度进行测定。cfDNA 完整性检测采用RT-PCR 技术测定血浆ALU115 基因（115bp）和ALU247 基因（247bp）浓度，以ALU115/ALU247 表示cfDNA 的完整性。ALU247 及ALU115 引物设计、合成及RT-PCR 方法见参考文献[5]。

1.3 统计方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用 检验；相关系数利用Correl 方程[6]计算。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇和新生儿血清TBA、CA水平比较 研究组孕妇血清TBA、CA水平均高于对照组（均＜0.05）。研究组新生儿脐静脉血TBA、CA 高于对照组（均＜0.05）。见表1 ～2。

表1 两组孕妇血清TBA、CA 浓度检测 mol/L

表2 两组胎儿脐静脉血TBA、CA 浓度检测 mol/L

2.2 两组孕妇、新生儿cfDNA 水平 两组孕妇cfDNA完整度差异无统计学意义（≤1.549，均＞0.05）；两组新生儿脐静脉血cfDNA 完整度差异有统计学意义（≥2.766，均＜0.05）。研究组孕妇cfDNA 含量（33.14±5.07）ng/ml，新生儿的cfDNA含量（30.15±4.20）ng/ml；对照组孕妇cfDNA含量（18.54±3.05）ng/ml，新生儿的cfDNA 含量（15.00±2.18）ng/ml。研究组产妇、新生儿cfDNA含量均高于对照组（=4.456、3.045，均＜0.05）。见表3。

表3 各组血浆cfDNA 完整度比较

2.3 孕妇cfDNA水平与新生儿TBA和CA 浓度之间的相关性 研究组孕妇cfDNA 水平与新生儿TBA 浓度与新生儿CA 浓度呈现正相关关系（=0.9805、0.9926，均＜0.05）。

3 讨论

ICP在我国较为高发，已被认为属于高危妊娠，临床医生可以通过孕期检查及时诊断、孕期密切监护患者及胎儿宫内情况、积极保肝治疗及适时终止妊娠等方式降低ICP 患者的并发症，降低围产儿病死率[7]。ICP 临床表现为血清TBA、CA增高，可达数倍甚至数10 倍[8]。CA的淤积会导致胎儿心肌损伤、心功能异常，而TBA 的升高会影响胎儿胰腺分泌功能变化，影响胎儿的生长发育[9]。本研究结果显示ICP孕妇血清TBA、CA水平明显高于正常孕妇，CA 增高达20 倍以上，研究组新生儿TBA、CA 水平也显著增高。这证明母体发生ICP 可使胎儿发生高胆汁酸血症。但目前临床仍对ICP的发病机制不甚明了，可能由环境因素、多胎妊娠、营养状态、免疫功能状态以及遗传代谢等多因素作用导致[10]。

cfDNA 检测在疾病的监控、胎儿的产前诊断及肿瘤的研究中已经有了很多应用，但是其含量测定与ICP 的关系研究甚少。本研究结果显示研究组孕妇和新生儿脐静脉血cfDNA 含量较对照组显著升高，且研究组孕妇外周血cfDNA含量与新生儿TBA、CA 存在正相关。这提示ICP 患者的cfDNA 水平升高可能是导致孕产妇和新生儿胆汁淤积的一个重要原因。由于cfDNA 的产生来源于细胞凋亡，故推测ICP 的机制是否和妊娠期细胞凋亡增加有关。目前研究表明，胎盘滋养细胞的异常凋亡可能与ICP 的发生及病程的进展密切相关[11]。这也从间接证明本研究的正确性。但直接的证据需要侵入性的操作获得，这就限制了进一步的临床研究。今后的研究方向更需进一步观察cfDNA 水平的异常和孕妇病情及新生儿健康程度的相关性。

综上所述，ICP对母婴特别是对胎儿危害极大，若处理不及时会导致新生儿并发症、甚至病死。因此，临床应早期诊断、早期处理，以达到缓解瘙痒症状、恢复肝功能、降低胆汁酸水平、降低cfDNA含量，同时要注意胎儿宫内的监护，及时发现胎儿异常症状并采取相关措施，以改善妊娠结局。