黄柏胶囊联合盐酸奥洛他定对急性湿疹模型大鼠的干预作用及抗过敏机制探讨

戴雅琴，杜崇民，谢惠平

(1. 江汉大学附属湖北省第三人民医院，湖北 武汉 430033；2. 青岛市即墨区中医医院，山东 青岛 266200)

急性湿疹又称为特应性皮炎，是临床多发、常见迟发型变态反应炎性皮肤疾病，表现为皮肤瘙痒、红斑、丘疹、水疱等，发病机制尚未明确，内、外致病因素共同致病[1-2]。目前西医主要应用类固醇激素或免疫调节剂治疗，短期效果较好，但停药易复发，长期反复应用易引起皮肤萎缩、色素沉着等不良反应，甚至出现内分泌代谢紊乱、诱发及加重感染等[3]。湿疹属中医“湿疮”范畴，多因机体较弱、卫外不固、营卫失和、阴阳失调、七情内伤，导致耗伤气血，阴血虚少，血虚而生风，风邪趁机侵袭而发病[4]。黄柏胶囊主要成分为中药黄柏，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮功效，治疗湿疹疗效较好，且无明显不良反应，但其作用机制尚不明确[5]。盐酸奥洛他定是肥大细胞稳定剂及相对选择性组胺H1受体拮抗剂，主要用于湿疹、多形性渗出性红斑的治疗。本研究探讨了黄柏胶囊联合盐酸奥洛他定对急性湿疹模型大鼠的干预作用及抗过敏机制，旨在为临床应用提供更多实验依据。

1 实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8周龄清洁级SD雄性大鼠50只，体质量(200±20)g，湖北省实验动物中心提供[SCXK-(鄂)2017-0011]，室温饲养，自由饮水。

1.1.2药品与试剂 黄柏胶囊(淄博华洋制药有限公司，国药准字Z20063055，生产批号：20190314，规格：每粒0.39 g)；盐酸奥洛他定(北京四环科宝制药有限公司，国药准字H20143415，生产批号：20190409，规格：5 mg/片)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,化学纯，成都科龙化工试剂厂，生产批号：20190117)；苏木精-伊红染色液(武汉华美生物工程有限公司)；兔抗鼠干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)多克隆抗体一抗试剂盒(碧云天生物科技有限公司)和二抗试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-4617R和bs-0920R)；BCA试剂盒和DAB显色液(碧云天生物科技有限公司，批号分别为201903171和201903115)；PVDF 膜(Millipore公司，批号：K5EA5859N)，山羊抗兔IgG(Abcam公司，批号：150077)，Trizol提取试剂盒(Takara公司，批号：AKA5101)，qPCR反应试剂盒(BIO-RAD公司，批号：L001751 A)，反转录试剂盒(Takara公司，批号：AK4102)，ICAM-1和VCAM-1引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.3实验仪器 手术器械(苏州六六视觉医疗设备公司)；LDZ-2 型低速离心机(北京京立离心机有限公司)；BX60显微镜(日本Olympus Optical公司)；ELx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；B-013003匀浆器(上海垒固仪器有限公司)；电泳仪和转膜仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司)]；SIM凝胶成像仪[美国西盟(国际)生命技术有限公司]；RT-PCR扩增分析系统(美国罗氏公司)。

1.2分组、造模及给药 将50雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组，每组10只。除对照组外，其余组均参照文献[6]方法进行急性湿疹造模：采用5%水合氯醛麻醉大鼠，电剃须刀或电推剪去除大鼠右侧背部被毛，面积约为2 cm×3 cm，将1滴5% DNCB涂于右侧背部以致敏，然后本别于第3天、第6天和第9天将1滴2% DNCB涂于右侧背部，以右侧背部出现明显的渗出、糜烂、丘疹、水肿、红斑等为造模成功。 于造模后第10天，对照组和模型组给予生理盐水灌胃，黄柏胶囊组给予0.2 g/mL黄柏胶囊溶液灌胃，盐酸奥洛他定组给予0.65 mg/mL盐酸奥洛他定溶液灌胃，联合组给予0.2 g/mL黄柏胶囊溶液和0.65 mg/mL盐酸奥洛他定溶液灌胃，剂量均为5 mL/kg，每天1次，连续10 d。

1.3检测指标

1.3.1湿疹度评分和皮肤肿胀度 于造模第20天，观察各组大鼠的抓痕、渗出、糜烂、丘疹、红斑、水肿等情况，根据症状轻重进行湿疹度评分[6]：症状无、轻、中、重分别计分0，1，2，3分，最高18分，评分越高，湿疹越严重。采用直径6 mm的圆形打孔器取健康区域和湿疹区域皮肤，计算皮肤肿胀度，皮肤肿胀度=湿疹皮肤质量-健康皮肤质量。

1.3.2组织HE染色病理观察 于造模第20天，处死各组大鼠，分离实验所需皮肤组织，4%多聚甲醛固定24 h，自来水冲洗，不同浓度的乙醇脱水，二甲苯透明固定，石蜡包埋，切片，厚度为5 μm，烤片，二甲苯脱蜡，乙醇水化，苏木精染色，1%盐酸乙醇溶液分化，自来水冲洗返蓝，浸入伊红染液，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶进行封片，显微镜下观察。

1.3.3炎症因子水平 处死各组大鼠前，心脏取血，离心，取上清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平，按照说明书操作。

1.3.4ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量 采用Western blot法检测：取100 mg皮肤组织标本，PBS缓冲液冲3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA低温研磨，离心取上清，BCA法检测蛋白浓度，562 nm测定OD值，计算蛋白浓度，将胶板安装于电泳槽中，倒入电泳液，按40 μg蛋白上样，电泳条件为电压80 V、30 min，样品进入分离胶后调节电压至120 V，电泳结束后，取出玻璃板，切去浓缩胶及分离胶，进行转膜，PVDF膜使用前浸于适量甲醇中活化，设置转膜条件(80 V、120 min)，冰浴，取出PVDF膜，37 ℃恒温摇床封闭2 h，将PVDF膜裁成长条，置于ICAM-1和VCAM-1一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃恒温摇床孵育过夜，1×TBST 洗PVDF膜3次，夹取PVDF膜置入二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG，1∶5 000)1 h，1×TBST 洗PVDF膜3次，DAB显色，凝胶成像系统分析蛋白表达条带灰度，计算ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量。

1.3.5ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达量 取皮肤组织标本100 mg，Trizol法提取总RNA，取1 μL提取的RNA，采用微量分光光度计于A260和A280检测提取的RNA纯度，去除DNA后以GAPDH为内参进行c DNA合成，采用RT-PCR和相关软件检测ICAM-1和VCAM-1 mRNA相对表达量，40个循环，预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min。引物序列：ICAM-1上游为5’-TCCAATGGCTTCAACCCGTG-3’,下游为5’-CTTCTGTGGGATGGATGGAT-3’，长度为110 bp；VCAM-1上游为5’-GAGACAAAACAGAAGTGGAAT-3’,下游为5’-AGCAACGTTGACATAAAGAGT-3’，长度为635 bp；GAPDH上游为5’-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3’,下游为5’-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3’，长度为278 bp。

2 结 果

2.1各组大鼠湿疹度评分和皮肤肿胀度比较 模型组大鼠湿疹度评分和皮肤肿胀度均显著高于对照组(P均<0.05)。黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组大鼠湿疹度评分和皮肤肿胀度均显著低于模型组(P均<0.05)，且联合组均显著低于黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组(P均<0.05)，黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠皮肤组织HE染色表现 对照组大鼠皮肤组织正常；模型组大鼠表皮突延长、棘层肥厚，角化过度，细胞间水肿及炎性细胞浸润；黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组可见部分棘细胞肿胀，表皮突稍长，角质层变薄，少量细胞间水肿及炎性细胞浸润。见图1。

2.3各组大鼠血清炎症因子水平比较 模型组大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均显著高于对照组(P均<0.05)。黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且联合组均显著低于黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组(P均<0.05)，黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠湿疹度评分和皮肤肿胀度比较

2.4各组大鼠皮肤组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达量比较 模型组大鼠皮肤组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达量均显著高于对照组(P均<0.05)。黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组大鼠皮肤组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达量均显著低于模型组(P均<0.05)，且联合组均显著低于黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组(P均<0.05)，黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2和表3。

图1 各组大鼠皮肤组织病理学HE染色表现(×400)

表2 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平比较

图2 各组大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白表达条带情况

3 讨 论

急性湿疹发生机制复杂，目前尚无特效治疗药物。西药盐酸奥洛他定属于二苯骄氧草类衍生物，能够抑制变应原诱发的血管通透性增高，减少渗出，可抑制肥大细胞游走，稳定肥大细胞膜，抑制嗜酸性粒细胞浸润，降低炎症细胞活性[7-8]，用于治疗湿疹近期效果明显，且不良反应相对较少。中成药黄柏胶囊主要成分为黄柏，黄柏中黄柏碱和木兰碱成分对细胞免疫应答的诱导期皆有抑制作用，可抑制迟发型超敏反应，提高机体免疫力，减轻炎症反应，促进病情恢复[9]；小檗碱成分具有抗菌、收敛和消炎作用，可降低血清炎症因子水平[10]。故本研究选择此两种药物进行了实验探讨。

湿疹是由内外致敏因子引起的疾病，致敏T细胞激活Th2免疫反应，释放IFN-γ、IL-4等炎性因子，造成组织损伤，单核细胞、淋巴细胞等浸润，故炎症反应、免疫调节异常与急性湿疹发病过程和发展预后密切相关[11-12]。IFN-γ可促进Th1细胞成熟，抑制Th2 细胞增殖，同时可刺激TNF-α等细胞因子的上调[13]。IL-4能调节T、B淋巴细胞，促进免疫应答反应过程，可通过抑制体内单核巨噬细胞释放TNF-α而发挥抗炎效应，但其过量表达有促炎作用[14]。TNF-α适量水平可增强机体免疫应答，抑制炎症反应，但过量表达可引起炎症区域组织损伤，加重炎症反应，促进IFN-γ、IL-4水平升高，加重急性湿疹造成的皮肤损害[15]。促炎因子和抗炎因子在炎症反应过程中具有相互拮抗和相辅相成的作用。本实验结果显示，黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组的湿疹度评分、皮肤肿胀度及血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平均显著低于模型组，且联合组各指标及病理形态改善更显著，提示黄柏胶囊与盐酸奥洛他定联合应用具有协同抗炎作用。

表3 各组大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA相对表达量比较

细胞黏附分子介导免疫细胞间的互动与活化，参与免疫应答、炎症损伤等。皮肤炎症反应过程中肥大细胞、巨噬细胞等分泌的炎症因子激活细胞内信号，诱导内皮细胞大量表达ICAM-1和VCAM-1，引起同种细胞间聚集并加重炎症[16]。ICAM-1表达于活化T细胞、角质形成细胞等，可稳定细胞和促进白细胞游走，正常组织中弱表达，炎症组织中高表达，影响T细胞的分化，介导炎症反应[17]。VCAM-1表达于内皮细胞、皮肤树突状细胞等，与众多蛋白结合形成信号复合体，为炎症细胞的激活提供关键的共刺激信号，可介导黏附淋巴细胞、嗜酸性粒细胞，VCAM-1与其受体结合是淋巴细胞活化的重要步骤，在皮肤炎症反应中发挥关键作用[18]。本实验结果显示，黄柏胶囊组、盐酸奥洛他定组和联合组ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表达水平均显著低于模型组，且联合组明显低于黄柏胶囊组和盐酸奥洛他定组，提示黄柏胶囊与盐酸奥洛他定联合应用可能通过下调细胞黏附分子表达而减轻急性湿疹的炎症反应。

综上所述，黄柏胶囊联合盐酸奥洛他定治疗急性湿疹可更明显减轻病情和改善组织病理形态，可能与下调炎症因子和ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA表达，减轻炎症反应有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。